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Pourquoi EtBr migre vers la direction opposée?

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Nous savions que l'ADN courrait vers l'électrode positive, car ils ont de l'électricité négative. alors pourquoi EtBr migre vers la direction opposée à l'ADN ? est-ce parce qu'ils ont de l'électricité positive?


Le bromure d'éthidium lui-même est neutre en charge, cependant dans un environnement aqueux c'est un ion positif et il se déplace vers l'électrode négative, à l'opposé de l'ADN, car l'ADN est chargé négativement et se déplace vers l'électrode positive.

Le truc, c'est que ça n'a pas tellement d'importance. Que vous prépariez un gel avec EtBr ajouté ou que vous ajoutiez de l'EtBr au tampon d'électrophorèse, il commencera instantanément à s'intercaler au moment où vous insérez votre échantillon ou commencez à exécuter le gel. Au moment où le courant électrique est appliqué, EtBr commencera en effet à migrer vers l'électrode négative, mais une quantité finie se serait déjà intercalée dans l'ADN et elle ne sera visible sous UV que lorsqu'elle est liée à l'ADN. Gardez cela à l'esprit que EtBr est une molécule beaucoup plus petite et pénètre facilement dans le gel, mais sera piégé entre les paires de bases d'ADN s'il en trouve.

Cela dit, comme l'a souligné l'un des commentateurs, si vos échantillons semblent avoir voyagé dans l'autre sens, vous avez probablement interverti les câbles. La charge de l'électrode dépend de la charge appliquée par la source de courant électrique et si vous vous méprenez sur les câbles, vous ferez en fait voyager les échantillons dans le sens inverse.


Les anions chargés négativement migrent vers l'électrode d'anode pendant l'électrophorèse. De même, les cations chargés positivement migrent vers l'électrode cathodique en électrophorèse. Les molécules neutres, dépourvues de toute charge nette, resteront immobilisées dans les puits de chargement. La charge nette d'une molécule dans un tampon aqueux dépend à la fois de la structure moléculaire et du pH du tampon. Si vous êtes d'accord avec tous ces faits, alors vous avez répondu à votre propre question.


Electrophorèse sur gel d'agarose pour la séparation de fragments d'ADN

L'électrophorèse sur gel d'agarose est le moyen le plus efficace de séparer des fragments d'ADN de différentes tailles allant de 100 pb à 25 kb(1). L'agarose est isolé des genres d'algues Gelidium et Gracilaria et se compose de sous-unités répétées d'agarobose (L- et D-galactose)(2). Lors de la gélification, les polymères d'agarose s'associent de manière non covalente et forment un réseau de faisceaux dont la taille des pores détermine les propriétés de tamisage moléculaire d'un gel. L'utilisation de l'électrophorèse sur gel d'agarose a révolutionné la séparation de l'ADN. Avant l'adoption des gels d'agarose, l'ADN était principalement séparé par centrifugation en gradient de densité de saccharose, qui ne fournissait qu'une approximation de la taille. Pour séparer l'ADN à l'aide d'une électrophorèse sur gel d'agarose, l'ADN est chargé dans des puits prémoulés dans le gel et un courant est appliqué. Le squelette phosphate de la molécule d'ADN (et d'ARN) est chargé négativement. Par conséquent, lorsqu'ils sont placés dans un champ électrique, les fragments d'ADN migreront vers l'anode chargée positivement. Parce que l'ADN a un rapport masse/charge uniforme, les molécules d'ADN sont séparées par taille dans un gel d'agarose dans un modèle tel que la distance parcourue est inversement proportionnelle au log de son poids moléculaire (3). Le modèle principal pour le mouvement de l'ADN à travers un gel d'agarose est la « reptation biaisée », par laquelle le bord d'attaque se déplace vers l'avant et entraîne le reste de la molécule (4). Le taux de migration d'une molécule d'ADN à travers un gel est déterminé par les éléments suivants : 1) taille de la molécule d'ADN 2) concentration en agarose 3) conformation de l'ADN (5) 4) tension appliquée, 5) présence de bromure d'éthidium, 6) type de agarose et 7) tampon d'électrophorèse. Après séparation, les molécules d'ADN peuvent être visualisées sous lumière UV après coloration avec un colorant approprié. En suivant ce protocole, les étudiants devraient être capables de : Comprendre le mécanisme par lequel les fragments d'ADN sont séparés dans une matrice de gel Comprendre comment la conformation de la molécule d'ADN déterminera sa mobilité à travers une matrice de gel Identifier une solution d'agarose de concentration appropriée pour leurs besoins Préparer un gel d'agarose pour l'électrophorèse des échantillons d'ADN Installer l'appareil d'électrophorèse sur gel et l'alimentation électrique Sélectionner une tension appropriée pour la séparation des fragments d'ADN Comprendre le mécanisme par lequel le bromure d'éthidium permet la visualisation des bandes d'ADN Déterminer les tailles des fragments d'ADN séparés.


1. Séquence et conformation des échantillons d'acide nucléique

Les principes de base de l'électrophorèse impliquent que les échantillons d'acide nucléique ont des taux de mobilité différents lorsqu'ils sont de tailles différentes. Cependant, les acides nucléiques avec le même nombre de nucléotides mais une composition de séquence et une conformation différentes peuvent avoir des mobilités différentes pendant l'électrophorèse (Figure 1).

  • Séquence: L'ADN riche en AT peut migrer plus lentement que l'ADN riche en GC de la même taille, en particulier en électrophorèse à haute résolution. De même, les molécules d'ADN avec 4 à 6 répétitions d'adénosine toutes les 10 pb environ (appelées ADN incurvé) migreront de manière irrégulière, en particulier dans les gels de polyacrylamide [1,2]. Leur migration anormale est probablement due à la composition des séquences affectant leur conformation moléculaire.
  • Conformation: La migration des molécules d'ADN de la même séquence mais de conformations différentes, telles que les plasmides circulaires et linéarisés, est affectée par la compacité de chaque conformation lorsqu'elles se déplacent à travers les pores du gel. Les molécules superenroulées très compactes migrent le plus rapidement, suivies des molécules linéaires flexibles et circulaires ouvertes (Figure 1). Cette migration différentielle peut être exploitée pour examiner l'intégrité de l'ADN plasmidique après isolement, car l'ADN plasmidique intact est souhaitable dans des applications telles que la transfection de cellules de mammifères pour la surexpression de gènes.

Figure 1. Migration électrophorétique du même ADN dans diverses conformations. (UNE) Électrophorèse d'ADN plasmidique circulaire, linéaire et superenroulé entaillé. (B) Conformation d'ADN plasmidique circulaire, linéaire et superenroulé détendu. Les plasmides entaillés assument une conformation circulaire ouverte et détendue et occupent le plus de volume, migrant le plus lentement à travers le gel. Les plasmides linéarisés se déplacent à travers le gel à une vitesse légèrement plus élevée.


Mouvement des chromosomes pendant l'anaphase (avec diagramme)

Au cours de la division nucléaire ou de la mitose, il se produit un changement progressif de la structure et de l'apparence des chromosomes.

Bien que la mitose soit un processus continu (Figs. 20-20 et 20-21), pour des raisons de commodité, elle est généralement divisée en quatre étapes principales : prophase, métaphase, anaphase et télophase.

La prophase, premier stade de la mitose, se caractérise par la condensation des chromosomes, la disparition des nucléoles et de l'enveloppe nucléaire, et la formation des microtubules du fuseau. Si, avant la prophase, la cellule contenait un centriole, alors un deuxième centriole est formé, les deux centrioles s'écartent au fur et à mesure que le fuseau se forme.

Les chromosomes se distinguent par microscopie optique en raison de leur raccourcissement et de leur épaississement progressifs et finalement on constate qu'ils sont composés de deux chromatides sœurs maintenues ensemble au centromère ou au kinétochore. Les chromatides sœurs sont les produits de la réplication de l'ADN chromosomique pendant l'interphase du cycle cellulaire.

Vers la fin de la prophase (parfois appelée prométaphase), le fuseau s'étend entre deux pôles positionnés diamétralement opposés dans la cellule et les chromosomes migrent vers le centre du fuseau. En métaphase, les centromères de chaque chromosome sont alignés à mi-chemin du fuseau sur un plan appelé plaque équatoriale.

A ce moment, les centromères sont liés aux fibres du fuseau. Certaines des fibres fusiformes ne forment pas d'associations avec des chromosomes et s'étendent directement d'un pôle à l'autre. Les centromères sont dupliqués de sorte que chaque chromatide devienne un chromosome indépendant et s'attache à une fibre fusiforme reliée à l'un des deux pôles.

Le début de l'anaphase est caractérisé par le mouvement des chromosomes vers les pôles opposés du fuseau. Au cours de l'anaphase, un processus appelé cytokinèse commence et divise la cellule en deux moitiés, séparant ainsi physiquement les deux compléments de chromosomes. La cytokinèse est distincte mais fréquemment synchronisée avec la division nucléaire, se produisant au cours des derniers stades de la mitose. Dans la phase finale de la mitose, appelée télophase, les chromosomes atteignent les pôles du fuseau et commencent à subir une décondensation. Au cours de la télophase, les nucléoles réapparaissent, ainsi qu'une nouvelle enveloppe nucléaire renfermant les chromosomes.

Mouvement des chromosomes pendant l'anaphase :

Au cours de l'anaphase de la mitose, le centromère de chaque chromosome avance vers l'un des deux pôles du fuseau, les bras des chromosomes étant à la traîne (fig. 20-21). Cette disposition suggère que les chromosomes sont attirés vers les pôles du fuseau. Depuis plusieurs années, de nombreux chercheurs tentent de déterminer la nature du mécanisme à l'origine de ce mouvement.

Parmi les différents modèles qui ont été proposés, citons :

(2) Le modèle de filament cytoplasmique glissant, et

(3) Le modèle d'équilibre dynamique.

Le modèle des microtubules a été proposé pour la première fois à la fin des années 1960 par J. R. Mcintosh. Selon Mcintosh, les microtubules s'étendent vers l'intérieur à partir des pôles du fuseau et se chevauchent au centre de la cellule. Au cours de l'anaphase, les microtubules glissent les uns sur les autres dans la zone de chevauchement, étendant ainsi la cellule et écartant davantage les pôles.

En même temps que les extrémités chevauchantes des microtubules glissent les unes sur les autres, d'autres microtubules reliant les centromères aux pôles sont démontés aux pôles. En conséquence, la longueur totale de ces microtubules est diminuée et les chromosomes se rapprochent des pôles. Parce que le glissement des microtubules est connu pour être impliqué dans d'autres formes de mouvement cellulaire, telles que le battement des cils et des flagelles, ce modèle est tout à fait plausible. Cependant, il semble que ce ne soit pas l'histoire complète.

En 1974, A. Forer a montré que des microfilaments d'actine sont présents dans le fuseau, et plus tard des filaments de myosine ont également été présents. Cela a incité à suggérer que c'est le glissement des filaments d'actine et de myosine l'un sur l'autre qui explique le mouvement des chromosomes.

Le rôle des microtubules a été relégué à celui de servir de cadre structurel sur lequel les chromosomes sont montés. Les mouvements des filaments cytoplasmiques ne sont pas reflétés par le mouvement correspondant des chromosomes jusqu'à ce que l'anaphase commence et que les microtubules commencent à se décomposer aux deux pôles du fuseau. En effet, le désassemblage des microtubules aux pôles libère les chromosomes pour qu'ils se déplacent en réponse au glissement de l'actine et de la myosine.

Selon le modèle d'équilibre dynamique proposé en 1967 par S. Inoue, les microtubules qui composent les fibres fusiformes sont en équilibre dynamique avec un pool de sous-unités de microtubules. L'ajout de nouvelles sous-unités aux fibres qui s'étendent d'un pôle du fuseau à l'autre mais n'ont pas de chromosomes attachés sert à augmenter la distance interpolaire, tout en supprimant en même temps les sous-unités des extrémités polaires ou du centromère. les extrémités des autres fibres fusiformes servent à les raccourcir et à rapprocher les chromosomes des pôles.

En plus des preuves biochimiques soutenant cette dernière notion, il est reconnu que le mouvement des chromosomes vers les pôles du fuseau pendant l'anaphase est un processus relativement lent par rapport aux mouvements de battement des cils et des flagelles et à la contraction des cellules musculaires. En effet, le mouvement de l'anaphase a lieu à une vitesse qui s'apparente davantage à la vitesse3 à laquelle les filaments croissent ou se raccourcissent par un afflux ou une perte de sous-unités.

De la discussion précédente, il est évident que plusieurs modèles différents essayant de rendre compte du mouvement des chromosomes pendant l'anaphase de la mitose sont soutenus par des observations indépendantes. Cela ne veut pas dire que le mécanisme réel n'implique peut-être pas une combinaison de tous les modèles.


Mouvement chromosomique en Anaphase | Biologie cellulaire

Les chromosomes sont impliqués dans une série de mouvements dirigés pendant la mitose et la méiose. Avec la séparation des chromatides sœurs/homologues à l'anaphase, l'équilibre est rompu, les chromosomes se déplacent vers les pôles au rythme d'environ 1 pm/min.

Par analyse hydrodynamique, il a été calculé qu'une force d'environ 10-11 dynes est nécessaire et que tout le déplacement de l'équateur au pôle d'un chromosome nécessite l'utilisation d'environ 30 molécules d'ATP.

Événements de mouvement chromosomique :

Au cours de la mitose, où les mouvements chromosomiques ont été étudiés en détail, les événements suivants ont été observés. Dans la prométaphase, la paire de chro­matidés est d'abord attirée vers le pôle du fuseau, puis migre vers le centre du fuseau.

Au début de l'anaphase, les chromatides se séparent et migrent lentement vers les pôles du fuseau (Fig. 5.18). Le mouvement anaphase des chromosomes comprend deux processus distincts : l'anaphase A et l'anaphase B.

L'anaphase A (anaphase précoce) implique le raccourcissement des microtubules associé au kinétochore (microtubules discontinus)

L'anaphase B (anaphase tardive) implique l'allongement des fibres entières du fuseau presque au double de leur longueur pour atteindre les pôles (microtubules continus).

Kinétochore est une structure en forme de plaque trilaminaire située au niveau de la constriction primaire du chromosome. Les chro­mosomes s'attachent avec des microtubules par kinétochore avant de se diriger vers les pôles. Le contact entre le microtubule et le kinétochore a lieu latéralement puis se transforme en attache polaire (Fig. 5.19).

Le kinétochore est censé être une structure passive qui reste attachée aux extrémités des microtubules tandis que les microtubules sont raccourcis lors du mouvement chromosomique en anaphase. Ce raccourcissement peut être dû au démontage ou à la dépolymérisation.

Les attractions des pôles kinétochore-broche entraînent un mouvement des chromosomes de sorte que lorsque deux chromatides se séparent, elles se déplacent automatiquement vers les pôles en raison de la dépolymérisation. Les fibres fusiformes discontinues portant les kinétochores se contractent et tirent les chromosomes vers les pôles tandis que les fibres continues s'allongent et maintiennent les pôles écartés.

L'élimination de la région polaire du fuseau affecte le mouvement des chromosomes, tandis que l'élimination des fibres du fuseau n'affecte pas le mouvement chromosomique vers le pôle. Ces résultats suggèrent que la région du kinétochore est principalement responsable du mouvement anaphasique fournissant la force motrice pour cela.

Mécanisme du mouvement des chromosomes :

Plusieurs hypothèses ont été tentées pour interpréter le mécanisme moléculaire du mouvement des chromosomes (Fig. 5.20).

Ostergreen (1949) a proposé l'hypothèse de l'équilibre dynamique où les événements de poly­mérisation et de dépolymérisation des micro­tubules sont directement responsables du mouvement des chromosomes. Selon cette hypothèse, l'énergie libérée (à partir de l'hydrolyse du GTP) est suffisante pour entraîner le mouvement des chromosomes pendant l'anaphase.

Cette hypothèse postule que les microtubules sont solidement ancrés au kinétochore, tandis que les extrémités polaires sont exemptes de désassemblage. Dans ce système d'ancrage-translocation, la force motrice serait fournie par l'assemblage-désassemblage polarisé des microtubules.

Selon l'hypothèse du glissement, les microtubules fusiformes s'assemblent et se désassemblent mais la force motrice n'est pas directement générée pour déplacer les chromosomes. Cette hypothèse postule que l'implication des interactions latérales des microtubules peut jouer un rôle analogue à la dynéine dans les flagelles.

De nombreuses observations, après avoir utilisé la protéine comme l'actine et la myosine, suggèrent que l'interaction de l'actine fusiforme avec la myosine ou la dynéine avec les microtubules pourrait fournir la force motrice tandis que la direction est fournie par les microtubules.

Rôle de la protéine motrice :

Récemment, deux protéines ont été identifiées, à savoir la kinésine et la dynéine cytoplasmique (Fig. 5.21), qui sont associées au kinétochore, se sont avérées être des structures dynamiques. Les forces générées par ces protéines sont de sens opposé : l'une est dirigée vers le pôle et l'autre en est éloigné.

La dynéine cytoplasmique peut être impliquée dans les mouvements polaires, tandis que la kinésine peut être impliquée dans le mouvement inverse vers le centre pendant la conférence. Ces deux protéines appartiennent à des familles plus larges et les mouvements basés sur les microtubules nécessitent une variété de protéines motrices, qui doivent être ciblées et activées pour amorcer leur fonction.

La kinésine possède deux domaines moteurs dirigés qui ont une activité ATPase et catalyse ainsi le mouvement par hydrolyse de l'ATP. La dyneine se compose de chaînes lourdes produisant de la force et d'une variété de sous-unités accessoires.

Rôle de la phosphorylation et de la déphosphorylation :

Des recherches récentes sur les forces impliquées dans les mouvements chromosomiques ont été étudiées en utilisant des techniques in vitro impliquant l'association de chromosomes isolés et de microtubules. Il a été démontré que les microtubules s'associent aux kinétochores et, en présence d'ATP, se déplacent vers l'extrémité négative (direction pôle ward).

En utilisant la technique des anticorps (anti-thiophosphate), le groupe thiophosphate a pu être localisé dans le kinétochore, suggérant que la phosphorylation d'un composant protéique du kinétochore conduit en fait à une inversion de la direction du mouvement des chromosomes.

Il est suggéré que la kinase et la phoshyphatase peuvent être associées au kinétochore et que deux protéines motrices (dynéine et kinésine) sont impliquées dans le développement de forces dans des directions opposées (Fig. 5.22).

Il a été démontré que la phosphorylation et la déphosphorylation différentielles de deux ATPases (phosphorylation facilitée par la kinase et déphosphorylation facilitée par la phosphatase) créent un équilibre unique pour soutenir le mouvement du chromosome. Bien que l'activité motrice de l'extrémité négative soit donnée par la dynéine située au niveau du kine­tochore, l'activité motrice de l'extrémité positive peut être due à une autre protéine comme la kinésine.

Rôle de la dépolymérisation et de la polymérisation des microtubules :

Outre la phosphorylation et la déphosphorylation, les microtubules croissent et rétrécissent en raison de la polymérisation et de la dépolymérisation au niveau du kinétochore. Ce phénomène suggère que l'activité motrice et la dynamique des microtubules sont coordonnées depuis et vers le pôle du fuseau pendant la division cellulaire.

Deux modèles ont été proposés pour expliquer la dépolymérisation des microtubules :

(i) Modèle Pac-man (les microtubules sont mâchés à l'extrémité du kinétochore)

(ii) Modèle de flux polaire (les microtubules sont dépolymérisés aux pôles) (Fig. 5.23).


Quel est un exemple de phototropisme négatif ?

Exemples de phototropisme Les racines des plantes présentent également un gravitropisme, c'est-à-dire une croissance en réponse à la gravité. Les tournesols sont un excellent exemple de phototropisme positif, car non seulement leurs tiges se courbent vers le léger mais leurs fleurs se tournent aussi pour faire face à la lumière du soleil.

Deuxièmement, qu'entend-on par phototropisme positif et phototropisme négatif, donnez un exemple de chaque type ? Donnez un exemple de chaque type. Réponse : Phototropisme positif est le mouvement d'une partie de la plante en réponse à un stimulus (lumière). La tige d'une plante pousse et se penche vers la lumière représente le phototropisme positif tandis que le mouvement des racines à l'abri de la lumière à l'intérieur du sol est un Exemple de phototropisme négatif.

En tenant compte de cela, où le phototropisme négatif se produit-il dans la plante ?

Résultats de la présent étude suggèrent que un phototropisme négatif peut se produire lorsque le niveau d'auxine ou de signalisation d'auxine est réduite à un niveau minimal, et que le phototropisme négatif est la réponse basale à l'irradiation unilatérale de lumière bleue dans plante organes axiaux.

Qu'est-ce qui est négativement phototrope ?

Phototropisme est la croissance d'un organisme en réponse à un stimulus lumineux. La croissance vers une source lumineuse est dite positive phototropisme, tandis que la croissance à l'abri de la lumière est appelée phototropisme négatif (skototropisme).


D'où viennent ces fibres ?

Le cytosquelette a probablement ses origines dans l'ascendance bactérienne et/ou archéenne. Il existe d'anciens parents à la fois de l'actine et de la tubuline dans les systèmes bactériens. Chez les bactéries, on pense que la protéine MreB et la protéine ParM sont les premiers ancêtres de l'actine. MreB fonctionne dans le maintien de la forme cellulaire et les fonctions ParM dans le partitionnement plasmidique (ADN). La protéine FtsZ dans les bactéries fonctionne dans la cytokinèse, c'est une GTPase, forme spontanément des filaments et est supposée être une ancienne forme de tubuline. Ces résultats soutiennent l'hypothèse que le cytosquelette eucaryote a ses origines dans le monde bactérien.


Pourquoi mon petit groupe est-il trop faible ? La PCR génomique ne fonctionne pas! - J'essaie juste de génotyper des souris. (Avr./01/2006 )

Je suis à bout de nerfs et j'apprécierais tous les conseils. J'essaie de faire fonctionner un protocole PCR de génotypage de souris. Les souris et le protocole proviennent d'un laboratoire de génétique extrêmement respecté - mais je n'arrive pas à faire fonctionner le protocole et je ne suis pas un biologiste moléculaire, mais j'ai essayé d'apprendre autant que possible pour faire cela travail.

Voici un résumé de ce que je fais :
Extraction d'ADN à l'aide d'un kit Qiagen - d'autres ont utilisé et adorent ce kit. Le laboratoire qui a développé les souris effectue des digestions prot K et des extractions au phénol/chloroforme sans kit.
Tubes autoclaves pour aliquotes d'ADN, PCR, amorces PCR.
PCR activé

300-900 ng d'ADN génomique de souris.
Utilisez les mêmes réactifs PCR des mêmes fournisseurs que ceux décrits par le laboratoire dans lequel le protocole a été développé : Taq régulier de Promega, Invitrogen Buffer E (a un pH spécifique conc. #33), DMSO, pas de Mg2+ supplémentaire, etc.
Volume rxn total : 25 ul.
Configurez les rxns sur la glace, ajoutez Taq à la dernière minute et démarrez la PCR.
Conditions de thermocyclage : 1 cycle : 2 min @ 94C 35-38 cycles : 30 sec @ 94C, 30 sec @ 60C, 1 min @ 72C puis 4C.
Exécutez les produits PCR sur un gel d'agarose à 1,5%, préparé et exécuté à l'aide du tampon LB (Faster Better Media), préparé à chaque fois. J'ajoute généralement 25 à 50 ug d'EtBr au gel.
(Et. Je porte toujours des gants, et je suis un pipeteur prudent et expérimenté.)

J'utilise 3 amorces : 1 spécifique aux souris WT, 1 spécifique aux souris KO, et 1 amorce commune. L'amorce commune est à deux fois la concentration des 2 autres amorces (0,3 ul, 100 uM).

Ce que je recherche : Bande KO : 600 pb. Bande WT : 400 pb. J'accouple des souris hétérozygotes qui ont des proportions normales de chaque génotype comme progéniture. Donc, je devrais voir un groupe KO dans

Au lieu de cela, je vois une bande KO (supérieure) forte à flamboyante dans

75 % de mes souris et une bande WT (inférieure) faible à presque nulle chez au plus 1/8 à 1/4 de mes souris. J'ai eu de meilleures réactions * une fois * et j'ai identifié quelques souris claires et WT - bien que la bande WT était encore un peu trop faible pour le confort de certaines souris. Mais, je n'ai jamais réussi à faire en sorte que mes réactions se déroulent aussi bien depuis, en utilisant le même & nouvel ADN.

À ce stade, j'ai essayé à peu près tout ce que je sais faire. J'ai essayé de faire varier la température de recuit de 47 à 60 °C - j'ai obtenu des bandes non spécifiques à des températures plus basses, mais étonnamment, pas une bande WT plus brillante. J'ai essayé d'augmenter la concentration d'amorce WT à 2x et 10x - cela vient de rendre ma bande KO plus faible. J'ai essayé de nouveaux tubes de tout plus d'une fois. J'ai essayé le protocole dans une machine PCR Stratagene avec un bras robotique et dans une machine Perkin-Elmer ordinaire - aucune différence. J'ai essayé d'utiliser plus d'ADN - cela aide, jusqu'à ce que les bandes disparaissent et soient remplacées par un frottis et peut-être une bande méga-kb quand je me lève

1,2 ug d'ADN ou plus. J'ai essayé d'allonger les temps à 94C, 60C et 72C de 30 secondes - aucune différence. J'ai essayé d'ajouter plus d'EtBr & en prenant des photos plus longues - cela aide dans une mesure limitée, mais vraiment, le groupe n'est tout simplement pas là, j'ai juste plus d'arrière-plan.

Qu'est-ce que je fais mal? Que puis-je faire pour que cela fonctionne. Toute aide sera appréciée!

Ce ne sont que des suppositions, mais quelques points à vérifier :

* Je n'étais pas sûr de ce que vous vouliez dire quand vous avez dit que vous aviez autoclavé des tubes pour votre amorce et votre ADN. Vouliez-vous dire que vous les avez autoclavés avant de les remplir ou que vous avez autoclavé vos amorces ? En général, je ne fais rien avec mes tubes - ils sont propres, et si vous en avez vraiment besoin stériles (rares), vous pouvez les acheter stériles. Les autoclaves provoquent une contamination croisée.

* Vos bandes peuvent disparaître en raison de la migration d'EtBr hors de votre gel. Vous pouvez tester cela en post-colorant votre gel dans du tampon + EtBr, ou en ajoutant de l'EtBr au puits tampon positif dans votre boîte de gel. EtBr migre vers l'électrode négative (direction opposée à celle de l'ADN) et peut décolorer des bandes de courte longueur.

* Vous ne dites pas quel kit Qiagen vous utilisez. Je suppose que c'est pour préparer l'ADN génomique, pas les plasmides.
J'irais moi-même avec du prot K et du phénol/chloroforme.

Merci beaucoup pour votre reponse.

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* Je n'étais pas sûr de ce que vous vouliez dire quand vous avez dit que vous aviez autoclavé des tubes pour votre amorce et votre ADN. Vouliez-vous dire que vous les avez autoclavés avant de les remplir ou que vous avez autoclavé vos amorces ? En général, je ne fais rien avec mes tubes - ils sont propres, et si vous en avez vraiment besoin stériles (rares), vous pouvez les acheter stériles. Les autoclaves provoquent une contamination croisée.
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J'ai autoclavé mes tubes avant de les remplir. D'après les discussions que j'ai eues avec diverses personnes sur les tubes d'autoclavage, les opinions semblent tellement varier. Vous êtes le premier à mentionner la question de la contamination croisée potentielle. D'autres ont dit définitivement d'autoclaver les tubes (éliminer les organismes potentiels), et d'autres ont dit définitivement de ne pas autoclaver les tubes (pourrait déformer les tubes). De toute évidence, cela ne peut pas être si grave de ne pas le faire, car tant de gens, y compris vous-même, jurent de ne pas le faire.

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* Vos bandes peuvent disparaître en raison de la migration d'EtBr hors de votre gel. Vous pouvez tester cela en post-colorant votre gel dans du tampon + EtBr, ou en ajoutant de l'EtBr au puits tampon positif dans votre boîte de gel. EtBr migre vers l'électrode négative (direction opposée à celle de l'ADN) et peut décolorer des bandes de courte longueur.
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Je soupçonne que cela pourrait être un point très pertinent - merci!

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* Vous ne dites pas quel kit Qiagen vous utilisez. Je suppose que c'est pour préparer l'ADN génomique, pas les plasmides.
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Oui, c'est pour préparer l'ADN génomique à partir de tissus animaux.

Merci encore pour votre aide et d'avoir pris le temps d'écrire. J'apprécie vraiment cela.


L'émergence d'un vortex bactérien expliquée

Les bactéries dans une goutte d'eau forment spontanément un vortex bidirectionnel, avec des bactéries près du centre de la goutte nageant dans la direction opposée des bactéries nageant près du bord. De nouvelles simulations informatiques, confirmées par une nouvelle expérience, expliquent comment ce vortex se forme.

Quand un tas de B. subtilis les bactéries sont confinées dans une goutte d'eau, une chose très étrange se produit. Le mouvement chaotique de tous ces nageurs individuels s'organise spontanément en un vortex tourbillonnant, avec des bactéries sur le bord extérieur de la gouttelette se déplaçant dans une direction tandis que celles à l'intérieur se déplacent dans la direction opposée.

Des chercheurs de l'Université Brown et de l'Université de Cambridge ont expliqué pour la première fois comment ce vortex à double mouvement est généré. À l'aide d'une modélisation informatique et d'une expérience intelligente, les chercheurs montrent que le flux de fluide généré par tous ces petits nageurs explique cet étrange mouvement dans les deux sens.

La recherche est publiée dans Actes de l'Académie nationale des sciences.

Hugo Wioland et d'autres dans le laboratoire de Raymond Goldstein à Cambridge ont démontré le phénomène pour la première fois expérimentalement en 2013. Mais à cette époque, la dynamique du système - en particulier le mouvement bidirectionnel - n'était pas entièrement comprise. Enkeleida Lushi, maintenant chercheuse postdoctorale à la Brown's School of Engineering et experte en modélisation théorique, a commencé à réfléchir à ce problème lors d'une bourse à Cambridge l'année dernière.

"Ce sont des organismes très simples", a déclaré Lushi. "Ils ne décident pas consciemment où aller et comment s'organiser. La plupart des dynamiques se produisent uniquement à cause de mécanismes physiques, comme les collisions les unes avec les autres et la frontière. Mais il n'y avait aucun moyen intuitif d'expliquer ce qui se passait avec le double mouvement vortex. C'était très déroutant.

Le modèle initial tentant de reproduire le phénomène s'est concentré sur les interactions mécaniques entre les bactéries individuelles. Ces simulations ont montré que lorsque des individus nageant selon des trajectoires aléatoires commencent à se heurter dans un espace circulaire confiné, ils ont tendance à s'orienter selon le même angle par rapport à la limite circulaire. Cela aide à expliquer comment commence un mouvement coordonné, mais ne peut pas expliquer pourquoi les individus vers l'extérieur du cercle se déplacent dans la direction opposée à ceux de l'intérieur.

Il s'avère que cette partie du phénomène est une question d'écoulement de fluide.

"Ces bactéries ne mesurent que quelques micromètres de long", a déclaré Lushi. "A cette échelle, le flux de fluide vers eux est très visqueux - très différent de ce que nous ressentons dans l'air ou même dans l'eau. L'effet est que tout mouvement effectué par les bactéries provoque des perturbations du flux qui seront fortement ressenties par leur voisins."

Lushi et ses collègues ont donc développé une simulation informatique, à droite, qui incluait les flux de fluide créés lorsque les bactéries nagent. B. subtilis nager en tournant de minuscules appendices en forme de tire-bouchon appelés flagelles. Le faisceau flagellaire pousse contre le fluide, ce qui propulse les bactéries vers l'avant et pousse le fluide dans la direction opposée.

Lorsque Lushi a inclus ces dynamiques dans sa simulation, la source du mouvement bidirectionnel est devenue claire. Les bactéries ont toutes tendance à s'aligner dans la même direction, a montré la simulation. Mais les individus nageant le long de l'extérieur du cercle ont créé un écoulement dans le fluide dans la direction opposée à la direction dans laquelle ils nagent. Les bactéries vers l'intérieur du cercle sont obligées de nager à contre-courant, mais ne peuvent pas tout à fait suivre. Ils finissent par se déplacer dans la même direction que le flux - la direction opposée des nageurs à l'extérieur.

Pour confirmer le modèle, les chercheurs ont mis en place une expérience avec de vraies bactéries, à droite, en utilisant des colorants colorés sur le corps de la bactérie et des flagelles pour déterminer la direction dans laquelle les bactéries étaient tournées. L'expérience a montré que toutes les bactéries tentaient en effet de nager dans la même direction. Mais ceux du milieu ont été balayés vers l'arrière, apparemment par le flux de fluide créé le long de l'extérieur. C'était exactement comme le modèle l'avait prédit.

"C'est un modèle très basique", a déclaré Lushi, "mais à la fin, il capture très bien ce phénomène. Il a montré que toute étude de microbes en suspension dans un liquide ne devrait pas ignorer le mouvement de ce liquide - cela pourrait avoir des répercussions importantes sur les microbes."

Alors pourquoi étudier le mouvement étrange des bactéries dans une goutte d'eau ?

"Nous voulons comprendre la nature où il y a de nombreux incidents d'unités individuelles indépendantes s'organisant collectivement - ce vortex bactérien n'est qu'un exemple", a déclaré Lushi. "Mais aussi, nous pourrions éventuellement vouloir contrôler les colonies bactériennes, par exemple pour limiter leur propagation. Plus nous comprenons comment elles interagissent et comment elles se déplacent collectivement, mieux nous pouvons concevoir des moyens de contrôler leur mouvement."


Southern Blot: Théorie et pratique

Gel de prétraitement

Transfert de l'ADN du gel à la membrane

La procédure de transfert ou de transfert est restée essentiellement inchangée depuis qu'elle a été décrite pour la première fois en 1975 et est illustrée à la figure 2. Fondamentalement, le gel est placé sur un morceau de papier filtre reposant sur un support dans un plateau contenant un tampon de transfert (une haute solution saline). La membrane est placée sur le gel, suivie de plus de papier filtre, d'une grosse pile de serviettes en papier et enfin d'un objet lourd tel qu'un livre de texte.

L'appareil de transfert du Sud. As the buffer travels up the filter paper wick through the layers of filter paper, gel, membrane and paper towels, the DNA is deposited from the gel to the membrane. The weight (say, a textbook) ensures that all of the layers remain in close contact during the transfer process.

There have been several modifications of the original blotting procedure described by Southern. These modified procedures attempt to decrease the transfer time and increase the efficiency of transfer. One procedure involves setting the transfer apparatus upside down so the gel is on the top. This downward capillary transfer aided by gravity, in addition to being faster than the conventional procedure, does not place excessive pressure on the gel, and thus there is no possibility of crushing it. Another modification, electroblotting, involves using an electrophoresis apparatus to mobilize the DNA from the gel on to the membrane. Vacuum blotting uses vacuum pressure to draw the transfer buffer through the gel.

DNA hybridization

Before hybridization is carried out, the membrane is treated with a blocking agent to prevent nonspecific association of probe with the membrane. A variety of polymeric inert agents, such as skim milk powder, Denhardt's reagent (a mixture of Ficoll, polyvinylpyrrolidone and bovine serum albumin), denatured fragmented salmon sperm DNA or heparin can be used to bind the unused DNA binding sites on the membrane. Skim milk powder and Denhardt's reagent are two most commonly used blocking agents. Skim milk powder is the cheapest and easiest to use, whereas Denhardt's reagent can more effectively block nylon membranes.

Détection


Voir la vidéo: ETBR Success Stories (Août 2022).