Informations

8.5 : Procédures de laboratoire - PCR et électrophorèse sur gel - Biologie

8.5 : Procédures de laboratoire - PCR et électrophorèse sur gel - Biologie



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Résultats d'apprentissage

  • Effectuer une PCR de colonie
  • Exécuter un gel d'agarose sur des produits PCR

PCR de colonie (pour l'analyse de séquence d'ARNr 16S)

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une technique moléculaire utilisée pour amplifier des régions spécifiques de l'ADN pour des applications telles que le séquençage et l'analyse génétique. Typiquement, il y a une quantité limitée d'ADN dans l'échantillon à étudier et une amplification est nécessaire. La PCR est réalisée dans un tube à essai avec la matrice d'ADN, des amorces spécifiques de la région souhaitée, de l'ADN polymérase et des réactifs qui stabilisent la réaction. Une fois la réaction mise en place, elle ira dans un thermocycleur (machine PCR) qui créera les conditions pour que la réplication de l'ADN se produise. Chaque cycle de PCR nécessite trois étapes, la dénaturation, l'hybridation et l'élongation, chacune doublant la quantité de matrice d'ADN présente dans la réaction. En répétant ce processus plusieurs fois, généralement 30, cela amplifiera l'ADN de manière exponentielle.

Méthode de billes PCR

Matériaux:

· Apprêt 27F (stock 20uM)

· Apprêt 1492R (stock 20uM)

· GE Illustra PuReTaq Ready to go PCR perle et tube

· Eau désionisée stérile sans nucléase (grade moléculaire)

· Plaque T-Streak avec isolat bactérien

· Micropipettes et pointes (P10, P100)

Procédures

Adapté du guide « GE Illustra PuRe Taq Ready to go PCR Beads »

  1. Procurez-vous des tubes à billes PCR, qui contiennent de la Taq polymérase (enzyme résistant à la chaleur) et d'autres réactifs nécessaires. À l'aide d'un sharpie, étiquetez le haut des tubes avec le numéro de réaction PCR attribué en classe. Assurez-vous de ne pas frotter accidentellement lors de la manipulation du tube et vérifiez lorsque vous placez le tube dans la machine PCR que votre étiquetage est toujours visible.
  2. Ajouter 25 L de Master mix (contient de l'eau de qualité moléculaire + des amorces d'ARNr 16S) dans le tube de billes PCR. La perle commencera à se dissoudre et à légèrement effervescent.
  3. Pendant que vous distribuez le mélange maître, insérez l'embout de la micropipette dans le mélange de façon à ce que vous voir le petit volume va directement dans le mix.
  4. À l'aide d'un embout de micropipette, touchez soigneusement la colonie sur la plaque à stries. Une petite quantité visible de cellules qui remplit à peine l'extrémité de la pointe de la pipette fournira suffisamment de matrice d'ADN pour la réaction.
  5. Tremper la pointe de la pipette dans le mélange réactionnel et agiter doucement pendant 5 à 10 secondes pour déloger les cellules. Bouchez les tubes. Évitez de former des bulles.
  6. Transférer les tubes vers le thermocycleur.
  7. Sélectionnez le programme approprié† pour démarrer le vélo (environ 2 heures).
  8. Une fois le cycle terminé, retirer les tubes et incuber sur de la glace. Suivez les instructions de votre instructeur sur le stockage et suivez les protocoles pour tester la qualité des produits PCR et les préparer pour le séquençage.

***Protocole adapté du guide « PuRe Taq Ready-To-Go PCR Beads »*

Amorces d'ARNr 16S :

Amorce avant (27F)

5’ – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG – 3’

Apprêt inversé (1492R)

5’ – ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT – 3’

Protocole de cycle PCR :

1. 94oC pendant 10 minutes

2. 94oC 30 sec – Étape de dénaturation

3. 58oC 30 sec - Étape de recuit

4. 72oC 1 min 50 sec (1 min par kb de matrice d'ADN) – Étape d'élongation

5. Répétez les étapes 2 à 4 30X

6. 72oC pendant 10min – Étape d'extension finale

Électrophorèse sur gel d'agarose

Pour la visualisation et l'analyse, nous devrons « exécuter » les produits de PCR sur un gel d'agarose. Le système E-gel d'Invitrogen sera utilisé. Ce système est un système complet sans tampon pour l'électrophorèse sur gel d'agarose. Il existe un gel d'agarose préfabriqué (E-gel) qui est un gel autonome qui comprend des électrodes emballées dans une cassette sèche, jetable et transparente aux UV. Le gel contient Sybr-safe ou du bromure d'éthidium pour la visualisation de l'ADN. L'E-gel fonctionne dans un seul appareil qui est à la fois une base et une alimentation, appelé E-gel Powerbase.

Le protocole et les images ci-dessous sont adaptés du guide technique E-gel d'Invitrogen.

Matériaux

· Échantillon d'ADN (issu de la réaction PCR)

· Marqueurs de poids moléculaire 1KB

· Chargement du mélange de colorants

Conditions générales d'Utilisation

· Exécuter des gels conservés à température ambiante

· Gardez les échantillons uniformes et chargez de l'eau déminéralisée dans des puits vides

· Chargez le gel dans les 15 minutes suivant l'ouverture du sachet

· L'E-gel ne peut être utilisé qu'une seule fois

Procédure

Préparation des échantillons et chargement du gel :

Préparez vos échantillons d'ADN en ajoutant de l'eau déminéralisée à la quantité requise d'ADN pour amener le volume total de l'échantillon à 20 ul.

1. L'instructeur de laboratoire ajoutera l'échelle 1Kb au gel.

2. Ajouter 4ul de réaction PCR au nouveau tube de microcentrifugation.

3. Ajouter 16ul de Loading dye Mix à ce tube de microcentrifugation.

4. Une fois que vous avez configuré la base de puissance E-gel (ci-dessous), chargez tout le volume de 20 ul dans le puits de gel approprié. Assurez-vous de noter dans quel puits de gel vous avez chargé votre échantillon.

Mise en place de l'E-gel Powerbase :

1. Branchez la Powerbase sur une prise électrique à l'aide de la fiche de l'adaptateur.

2. Ouvrez l'emballage contenant le gel et insérez le gel (avec le bouton en place) dans le bord droit de l'appareil en premier. Appuyez fermement en haut et en bas pour asseoir le gel dans la base. Vous devriez entendre un claquement lorsqu'il est en place. Le logo Invitrogen doit être situé au bas de la base, à proximité du pôle positif. Voir schéma ci-dessous. Une lumière rouge fixe indique que l'E-gel est correctement inséré (Mode Prêt).

Nettoyage PCR

Le processus de nettoyage PCR est effectué à l'aide d'un produit commercial. En fonction de la disponibilité des différents kits commerciaux, votre TA déterminera et fournira le kit à utiliser en laboratoire. Les instructions seront fournies avec le kit.


8.5 : Procédures de laboratoire - PCR et électrophorèse sur gel - Biologie

Électrophorèse sur gel : TAE & agarose/colorant de charge

Aujourd'hui, j'ai commencé ma journée en découvrant l'électrophorèse sur gel.

Après PCR, l'électrophorèse sur gel permet d'identifier le brin d'ADN que nous avons copié.

Un tampon d'électrophorèse, généralement du Tris-acétate-EDTA (TAE), a été utilisé et a été mélangé avec de la poudre d'agarose pour obtenir une concentration de gel d'agarose dans une plage de 0,5 à 1,4 %. Habituellement, dans la plupart des cas, la concentration du gel d'agarose est fixée à 1%.

Lorsque 0,4 gramme de poudre d'agarose est utilisé, alors 40 ml de TAE sont mélangés pour former le gel d'agarose. Le gel d'agarose est chauffé au micro-ondes pendant 2-3 minutes et est versé dans un récipient en plastique pendant 30 minutes pour sécher.

Après séchage, chaque échantillon d'ADN est inséré dans les espaces du peigne (également appelé puits). L'ADN est inséré dans le colorant de chargement. Lorsque vous utilisez la pipette pour insérer l'échantillon d'ADN, veillez à ne pas endommager le gel qui a été fabriqué précédemment. La pipette ne doit jamais entrer en contact avec le gel. Le colorant de charge est souvent de couleur violette ou bleue qui aide l'ADN à couler dans le gel jusqu'aux espaces des peignes (puits) et aide à protéger l'ADN. Si le colorant de charge n'est pas utilisé, l'ADN flottera et nous ne pourrons pas suivre l'ADN. Ensuite, l'électricité (source d'alimentation) est connectée au récipient en plastique afin que l'ADN chargé négativement puisse voyager de l'électrode chargée '-' à l'électrode chargée '+' en conséquence. Les petits échantillons se déplacent plus rapidement et se trouvent donc plus près de l'électrode chargée '+', tandis que les échantillons plus gros se déplacent plus lentement et se trouvent donc plus près de l'électrode chargée '-'.

Après avoir connecté la source d'alimentation, une partie du récipient/peigne en plastique est déplacée vers le gel doc, où la caméra UV prend une photo de l'échantillon d'ADN.


Protocole

1. Concevoir des amorces

La conception d'amorces appropriées est essentielle au succès d'une expérience PCR. Lors de la conception d'un ensemble d'amorces pour une région spécifique d'ADN souhaitée pour l'amplification, une amorce doit s'hybrider au brin plus, qui par convention est orienté dans la direction 5' → 3' (également connu sous le nom de brin sens ou non-modèle) et l'autre amorce doit compléter le brin moins, qui est orienté dans la direction 3' → 5' (brin antisens ou matrice). Il existe quelques problèmes courants qui surviennent lors de la conception des amorces : 1) auto-annelage des amorces entraînant la formation de structures secondaires telles que des boucles en épingle à cheveux (Figure 1a) 2) l'hybridation des amorces entre elles, plutôt qu'avec la matrice d'ADN, créant des dimères d'amorces (Figure 1b) 3) températures de fusion radicalement différentes (Tm) pour chaque amorce, ce qui rend difficile la sélection d'une température d'hybridation qui permettra aux deux amorces de se lier efficacement à leur séquence cible pendant le cycle thermique (Figure 1c) (Voir les sections CALCUL DE LA TEMPÉRATURE DE FUSION (Tm) et MODIFICATIONS DES CONDITIONS DE CYCLISME pour plus d'informations sur Tms).

Vous trouverez ci-dessous une liste de caractéristiques à prendre en compte lors de la conception des amorces.

La longueur de l'amorce doit être de 15 à 30 résidus nucléotidiques (bases).

La teneur optimale en G-C doit se situer entre 40 et 60 %.

L'extrémité 3' des amorces doit contenir un G ou un C afin de serrer l'amorce et d'empêcher la « respiration » des extrémités, augmentant ainsi l'efficacité de l'amorçage. La "respiration" de l'ADN se produit lorsque les extrémités ne restent pas recuites mais s'effilochent ou se séparent. Les trois liaisons hydrogène dans les paires GC aident à empêcher la respiration mais augmentent également la température de fusion des amorces.

Les extrémités 3' d'un ensemble d'amorces, qui comprend une amorce brin plus et une amorce brin moins, ne doivent pas être complémentaires l'une de l'autre, et l'extrémité 3' d'une seule amorce ne peut pas non plus être complémentaire d'autres séquences dans l'amorce. Ces deux scénarios entraînent respectivement la formation de dimères d'amorces et de structures en boucle en épingle à cheveux.

Températures de fusion optimales (Tm) pour les amorces comprises entre 52-58 ଌ, bien que la plage puisse être étendue à 45-65 ଌ. Le T finalm pour les deux amorces ne doit pas différer de plus de 5 ଌ.

Les répétitions dinucléotidiques (par exemple, GCGCGCGCGC ou ATATATATAT) ou les analyses à base unique (par exemple, AAAAA ou CCCCC) doivent être évitées car elles peuvent provoquer un glissement le long du segment amorcé de l'ADN et/ou des structures en boucle en épingle à cheveux. Si cela est inévitable en raison de la nature de la matrice d'ADN, n'incluez que des répétitions ou des analyses de base unique avec un maximum de 4 bases.

Remarques:

Il existe de nombreux programmes informatiques conçus pour aider à la conception de paires d'amorces. L'outil de conception NCBI Primer http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ et Primer3 http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ sont des sites Web recommandés à cet effet.

Afin d'éviter l'amplification de pseudogènes ou d'homologues apparentés, il pourrait être utile d'effectuer un blast sur NCBI pour vérifier la spécificité cible des amorces.

2. Matériaux et réactifs

Lors de la mise en place d'une expérience PCR, il est important d'être préparé. Porter des gants pour éviter de contaminer le mélange réactionnel ou les réactifs. Inclure un contrôle négatif, et si possible un contrôle positif.

Disposez tous les réactifs nécessaires à l'expérience PCR dans un seau à glace fraîchement rempli et laissez-les décongeler complètement avant de mettre en place une réaction (Figure 2). Gardez les réactifs sur la glace tout au long de l'expérience.

Les réactifs PCR standard comprennent un ensemble d'amorces appropriées pour le gène cible ou le segment d'ADN souhaité à amplifier, l'ADN polymérase, un tampon pour l'ADN polymérase spécifique, des désoxynucléotides (dNTP), une matrice d'ADN et de l'eau stérile.

Les réactifs supplémentaires peuvent inclure le sel de magnésium Mg 2+ (à une concentration finale de 0,5 à 5,0 mM), le sel de potassium K + (à une concentration finale de 35 à 100 mM), le diméthylsulfoxyde (DMSO à une concentration finale de 1-10%) , formamide (à une concentration finale de 1,25-10%), albumine de sérum bovin (à une concentration finale de 10-100 μg/ml) et bétaïne (à une concentration finale de 0,5 M à 2,5 M). Les additifs sont discutés plus en détail dans la section de dépannage.

Organiser l'équipement de laboratoire sur l'établi.

Le matériel comprend des tubes et bouchons PCR, un support de tubes PCR, un marqueur résistant à l'éthanol et un ensemble de micropipettes qui distribuent entre 1 - 10 μl (P10), 2 - 20 μl (P20), 20 - 200 & #x003bcl (P200) et 200 - 1000 μl (P1000), ainsi qu'un thermocycleur.

Lors de la mise en place de plusieurs expériences PCR qui utilisent toutes les mêmes réactifs, elles peuvent être mises à l'échelle de manière appropriée et combinées dans un mélange maître (Master Mix). Cette étape peut être effectuée dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,8 ml (voir Notes).

Pour analyser les amplicons résultant d'une expérience PCR, des réactifs et du matériel pour l'électrophorèse sur gel d'agarose sont nécessaires. Pour approximer la taille d'un produit de PCR, une norme de taille de poids moléculaire appropriée et disponible dans le commerce est nécessaire.

3. Mise en place d'un mélange réactionnel

Commencez par faire un tableau des réactifs qui seront ajoutés au mélange réactionnel (voir Tableau 1).

Ensuite, étiquetez les tubes PCR avec le marqueur résistant à l'éthanol.

Les volumes de réaction varieront en fonction des concentrations des réactifs de base. Les concentrations finales (CF) pour une réaction typique de 50 μl sont les suivantes.

Tampon X (généralement fourni par le fabricant de l'ADN polymérase peut contenir 15 mM de MgCl2). Ajouter 5 μl de tampon 10X par réaction.

200 μM dNTP (50 μM de chacun des quatre nucléotides). Ajouter 1 μl de 10 mM de dNTP par réaction (dATP, dCTP, dTTP et dGTP sont à 2,5 mM chacun).

1,5 mM de Mg2+. Ajoutez uniquement s'il n'est pas présent dans le tampon 10X ou si nécessaire pour l'optimisation PCR. Par exemple, pour obtenir les 4,0 mM de Mg 2+ nécessaires à la production optimale d'amplicons d'un segment d'ADN conservé de 566 pb trouvé dans un mycobactériophage non caractérisé, ajoutez 8 μl de 25 mM de MgCl2 à la réaction (figure 3).

20 à 50 pmol de chaque amorce. Ajouter 1 μl de chaque apprêt 20 μM.

Ajouter 10 4 à 10 7 molécules (ou environ 1 à 1000 ng) matrice d'ADN. Ajouter 0,5 μl d'ADN de mycobactériophage génomique 2ng/μl.

Ajouter 0,5 à 2,5 unités d'ADN polymérase par réaction de 50 μl (Voir les recommandations des fabricants) Par exemple, ajouter 0,5 μl de Sigma 0,5 Unités/μl Taq ADN polymérase.

Ajouter Q.S. de l'eau distillée stérile pour obtenir un volume final de 50 μl par réaction comme prédéterminé dans le tableau des réactifs (Q.S. est une abréviation latine pour quantum satis signifiant la quantité nécessaire). Ainsi, 33 μl par réaction sont nécessaires pour porter le volume à 50 μl. Cependant, il est à noter que l'eau est ajoutée en premier mais nécessite dans un premier temps de faire un tableau des réactifs et de déterminer les volumes de tous les autres réactifs ajoutés à la réaction.

4. Protocole PCR de base

Placer une plaque à 96 puits dans le seau à glace comme support pour les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml. Permettre aux réactifs PCR d'être ajoutés dans des tubes PCR froids à paroi mince de 0,2 ml aidera à prévenir l'activité de la nucléase et l'amorçage non spécifique.

Pipeter les réactifs PCR suivants dans l'ordre suivant dans un tube PCR à paroi mince de 0,2 ml (Figure 4) : Eau stérile, tampon PCR 10X, dNTP, MgCl2, amorces et matrice d'ADN (voir Tableau 1). Étant donné que les expériences doivent avoir au moins un contrôle négatif et éventuellement un contrôle positif, il est avantageux de mettre en place un Master Mix dans un tube de microcentrifugeuse de 1,8 ml (voir l'explication dans les notes).

Dans des tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml séparés (Figure 4) ajouter tous les réactifs à l'exception de l'ADN matrice pour un contrôle négatif (augmenter l'eau pour compenser le volume manquant). De plus, une autre réaction (si des réactifs sont disponibles) doit contenir un contrôle positif utilisant de l'ADN matrice et/ou des amorces connues pour s'amplifier dans les mêmes conditions que les tubes PCR expérimentaux.

Taq L'ADN polymérase est généralement stockée dans une solution de glycérol à 50 % et pour une dispersion complète dans le mélange réactionnel, il faut un mélange doux des réactifs PCR en pipetant vers le haut et vers le bas au moins 20 fois. La micropipette doit être réglée à environ la moitié du volume de réaction du mélange maître lors du mélange, et des précautions doivent être prises pour éviter d'introduire des bulles.

Mettez des bouchons sur les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml et placez-les dans le thermocycleur (Figure 5). Une fois le couvercle du thermocycleur bien fermé, démarrez le programme (voir Tableau 2).

Une fois le programme terminé, les tubes PCR à paroi mince de 0,2 ml peuvent être retirés et conservés à 4 ଌ. Les produits de PCR peuvent être détectés en chargeant des aliquotes de chaque réaction dans des puits d'un gel d'agarose, puis en colorant l'ADN qui a migré dans le gel après électrophorèse avec du bromure d'éthidium. Si un produit PCR est présent, le bromure d'éthidium s'intercalera entre les bases des brins d'ADN, permettant de visualiser les bandes avec un illuminateur UV.

Remarques:

Lors de la mise en place de plusieurs expériences de PCR, il est avantageux d'assembler un mélange de réactifs commun à toutes les réactions (c'est-à-dire Master Mix). Habituellement, le cocktail contient une solution d'ADN polymérase, de dNTP, de tampon de réaction et d'eau assemblée dans un tube de microcentrifugation de 1,8 ml. La quantité de chaque réactif ajouté au Master Mix est équivalente au nombre total de réactions plus 10 % arrondi à la réaction entière la plus proche. Par exemple, s'il y a 10 x 0,1 = 1 réaction, alors (10 + 1) x 5 μl 10X buffer équivaut à 55 μl de 10X buffer pour le Master Mix. Les réactifs du Master Mix sont soigneusement mélangés en pompant doucement le piston d'une micropipette de haut en bas environ 20 fois comme décrit ci-dessus. Chaque tube PCR reçoit une aliquote du Master Mix auquel la matrice d'ADN, les amorces requises et les réactifs spécifiques à l'expérience sont ensuite ajoutés (voir Tableaux 1 et 7).

Le site Web suivant propose une calculatrice pour déterminer le nombre de copies d'une matrice d'ADN (http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.html). Le nombre total de copies d'ADN double brin peut être calculé à l'aide de l'équation suivante : Nombre de copies d'ADN = (quantité d'ADN (ng) x 6,022x10 23 ) / (longueur d'ADN x 1x10 9 ng/ml x 650 Daltons) Le calcul du nombre de copies d'ADN est utilisé pour déterminer la quantité de matrice nécessaire par réaction.

Des faux positifs peuvent survenir à la suite d'un transfert d'une autre réaction PCR qui serait visualisé comme de multiples produits indésirables sur un gel d'agarose après électrophorèse. Par conséquent, il est prudent d'utiliser une technique appropriée, d'inclure un contrôle négatif (et un contrôle positif lorsque cela est possible).

Bien que le bromure d'éthidium soit la tache la plus courante pour les acides nucléiques, il existe plusieurs alternatives plus sûres et moins toxiques. Le site Web suivant décrit plusieurs des alternatives, y compris le bleu de méthylène, le violet cristal, le SYBR Safe et le rouge gel, ainsi que des descriptions de la façon d'utiliser et de détecter le produit final (http://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- alternatives/).

Alors que la plupart des machines PCR modernes utilisent des tubes de 0,2 ml, certains modèles peuvent nécessiter des réactions dans des tubes de 0,5 ml. Consultez le manuel de votre thermocycleur pour déterminer la taille de tube appropriée.

5. Calcul de la température de fusion (Tm)

Connaissant la température de fusion (Tm) des amorces est impératif pour une expérience PCR réussie. Bien qu'il existe plusieurs Tm calculatrices disponibles, il est important de noter que ces calculs sont une estimation du T réelm en raison du manque d'informations spécifiques sur une réaction particulière et des hypothèses formulées dans les algorithmes pour le Tm calculatrices elles-mêmes. Cependant, les modèles thermodynamiques du plus proche voisin sont préférés au calcul plus conventionnel : Tm ≈ 4(G-C) + 2(A-T). Le premier donnera T plus précism estimation car elle prend en compte l'énergie d'empilement des paires de bases voisines. Ce dernier est utilisé plus fréquemment car les calculs sont simples et peuvent être effectués rapidement à la main. Voir la section Dépannage pour plus d'informations sur la manière dont les diverses conditions de PCR et les additifs affectent la température de fusion. Pour calculer le Tm valeurs par les modèles thermodynamiques les plus proches, l'un des calculateurs suivants est recommandé : http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/ http://www.cnr.berkeley.edu/

6. Configuration des conditions de cyclage thermique

Les thermocycleurs PCR chauffent et refroidissent rapidement le mélange réactionnel, permettant la dénaturation induite par la chaleur de l'ADN duplex (séparation des brins), l'annelage des amorces aux brins plus et moins de la matrice d'ADN et l'allongement du produit PCR. Les temps de cycle sont calculés en fonction de la taille de la matrice et de la teneur en GC de l'ADN. La formule générale commence par une étape de dénaturation initiale à 94 ଌ à 98 ଌ en fonction de la température optimale pour l'activité de l'ADN polymérase et la teneur en G-C de l'ADN matrice. Une réaction typique commencera par une dénaturation d'une minute à 94 ଌ. Une durée supérieure à 3 minutes peut inactiver l'ADN polymérase, détruisant son activité enzymatique. Une méthode, connue sous le nom de PCR à démarrage à chaud, prolonge considérablement le temps de dénaturation initial de 3 minutes à 9 minutes. Avec la PCR à démarrage à chaud, l'ADN polymérase est ajoutée une fois l'étape initiale de dénaturation exagérée terminée. Cette modification du protocole évite l'inactivation probable de l'enzyme ADN polymérase. Reportez-vous à la section Dépannage de ce protocole pour plus d'informations sur la PCR de démarrage à chaud et d'autres méthodes alternatives.

L'étape suivante consiste à régler le thermocycleur pour qu'il initie le premier des 25 à 35 cycles d'un cycle de température en trois étapes (Tableau 2). Alors qu'augmenter le nombre de cycles au-dessus de 35 entraînera une plus grande quantité de produits de PCR, un trop grand nombre de cycles entraîne souvent l'enrichissement de produits secondaires indésirables. Les trois étapes de température dans un seul cycle accomplissent trois tâches : la première étape dénature la matrice (et dans les cycles ultérieurs, les amplicons également), la deuxième étape permet un annelage optimal des amorces, et la troisième étape permet à l'ADN polymérase de se lier à la matrice d'ADN et synthétiser le produit PCR. La durée et la température de chaque étape d'un cycle peuvent être modifiées pour optimiser la production de l'amplicon souhaité. La durée de l'étape de dénaturation est maintenue aussi courte que possible. Habituellement, 10 à 60 secondes suffisent pour la plupart des matrices d'ADN. Le temps et la température de dénaturation peuvent varier en fonction de la teneur en G-C de l'ADN matrice, ainsi que du taux de rampe, qui est le temps qu'il faut au thermocycleur pour passer d'une température à l'autre. La température pour cette étape est généralement la même que celle utilisée pour la phase de dénaturation initiale (étape 1 ci-dessus, par exemple, 94 ଌ). Une étape de recuit de 30 secondes suit dans le cycle à une température réglée à environ 5 ଌ en dessous du T apparentm des amorces (idéalement entre 52 ଌ à 58 ଌ). Le cycle se termine par une étape d'allongement. La température dépend de l'ADN polymérase choisie pour l'expérience. Par exemple, Taq L'ADN polymérase a une température d'élongation optimale de 70 ଌ à 80 ଌ et nécessite 1 minute pour allonger les 2 premiers kb, puis nécessite une minute supplémentaire pour chaque 1 kb supplémentaire amplifié. L'ADN polymérase Pfu est une autre enzyme thermostable qui a une température d'élongation optimale de 75 ଌ. L'ADN polymérase Pfu est recommandée pour une utilisation dans les réactions de PCR et d'extension d'amorce qui nécessitent une haute fidélité et nécessitent 2 minutes pour chaque 1 kb à amplifier. Voir les recommandations du fabricant pour les températures d'élongation exactes et le temps d'élongation indiqués pour chaque ADN polymérase spécifique.

La phase finale du cycle thermique comprend une période d'allongement prolongée de 5 minutes ou plus. Cette dernière étape permet de terminer la synthèse de nombreux amplicons inachevés et, dans le cas de Taq L'ADN polymérase permet l'ajout d'un résidu adénine aux extrémités 3' de tous les produits PCR. Cette modification est médiée par l'activité transférase terminale de Taq ADN polymérase et est utile pour les procédures de clonage moléculaire ultérieures qui nécessitent un débord 3'.

La fin de la réaction est obtenue en refroidissant le mélange à 4 ଌ et/ou par l'ajout d'EDTA à une concentration finale de 10 mM.

7. Considérations importantes lors du dépannage de la PCR

Si les conditions PCR standard ne donnent pas l'amplicon souhaité, une optimisation PCR est nécessaire pour obtenir de meilleurs résultats. La rigueur d'une réaction peut être modulée de telle sorte que la spécificité est ajustée en modifiant les variables (par exemple, les concentrations de réactif, les conditions de cycle) qui affectent le résultat du profil d'amplicon. Par exemple, si la réaction n'est pas assez rigoureuse, de nombreux amplicons parasites seront générés avec des longueurs variables. Si la réaction est trop stricte, aucun produit ne sera produit. Le dépannage des réactions PCR peut parfois être une entreprise frustrante. Cependant, une analyse minutieuse et une bonne compréhension des réactifs utilisés dans une expérience PCR peuvent réduire le temps et les essais nécessaires pour obtenir les résultats souhaités. De toutes les considérations qui ont un impact sur la stringence de la PCR, le titrage du Mg 2+ et/ou la manipulation des températures de recuit résoudront probablement la plupart des problèmes. Cependant, avant de changer quoi que ce soit, assurez-vous qu'un résultat erroné n'est pas dû à une erreur humaine. Commencez par confirmer que tous les réactifs ont été ajoutés à une réaction donnée et que les réactifs n'étaient pas contaminés. Notez également le résultat erroné et posez les questions suivantes : Les dimères d'amorces sont-ils visibles sur le gel après électrophorèse (ceux-ci se présentent sous forme de petites bandes 𼄀 b près du bas de la piste) ? Existe-t-il des produits non spécifiques (bandes qui migrent à une taille différente du produit souhaité) ? Y avait-il un manque de produit ? L'ADN cible est-il sur un plasmide ou dans un extrait d'ADN génomique ? En outre, il est sage d'analyser la teneur en G-C de l'amplicon souhaité.

Déterminez d'abord si l'un des réactifs PCR est catastrophique pour votre réaction. Cela peut être réalisé en préparant de nouveaux réactifs (par exemple, des stocks de travail frais, de nouvelles dilutions), puis en ajoutant systématiquement un nouveau réactif à la fois aux mélanges réactionnels. Ce processus déterminera quel réactif était le coupable de l'échec de l'expérience PCR. Dans le cas d'ADN très ancien, qui accumule souvent des inhibiteurs, il a été démontré que l'ajout d'albumine de sérum bovin peut aider à atténuer le problème.

Des dimères d'amorces peuvent se former lorsque les amorces s'auto-hybrident de préférence ou s'hybrident à l'autre amorce dans la réaction. Si cela se produit, un petit produit de moins de 100 pb apparaîtra sur le gel d'agarose. Commencez par modifier le rapport de la matrice à l'amorce si la concentration d'amorce est en excès extrême par rapport à la concentration de matrice, alors les amorces seront plus susceptibles de s'hybrider entre elles ou entre elles sur la matrice d'ADN. L'ajout de DMSO et/ou l'utilisation d'une méthode de cycle thermique de démarrage à chaud peut résoudre le problème. En fin de compte, il peut être nécessaire de concevoir de nouvelles amorces.

Des produits non spécifiques sont produits lorsque la stringence PCR est excessivement faible, ce qui entraîne des bandes PCR non spécifiques avec des longueurs variables. Cela produit un effet d'échelle sur un gel d'agarose. Il est alors conseillé de choisir des conditions de PCR qui augmentent la stringence. Un frottis de différentes tailles peut également résulter d'amorces conçues pour des séquences hautement répétitives lors de l'amplification de l'ADN génomique. Cependant, les mêmes amorces peuvent amplifier une séquence cible sur un plasmide sans rencontrer le même problème.

Le manque de produits PCR est probablement dû à des conditions de réaction trop strictes. Les dimères d'amorces et les structures en boucle en épingle à cheveux qui se forment avec les amorces ou dans l'ADN matrice dénaturé peuvent également empêcher l'amplification des produits de PCR car ces molécules peuvent ne plus s'apparier avec la contrepartie d'ADN souhaitée.

Si la teneur en G-C n'a pas été analysée, il est temps de le faire. La PCR des régions riches en G-C (contenu en GC 㹠%) pose certains des plus grands défis de la PCR. Cependant, il existe de nombreux additifs qui ont été utilisés pour aider à atténuer les problèmes.

8. Manipulation des réactifs PCR

Comprendre la fonction des réactifs utilisés sur la PCR conventionnelle est essentiel pour décider d'abord de la meilleure façon de modifier les conditions de réaction pour obtenir le produit souhaité. Le succès peut simplement dépendre de la modification de la concentration de MgCl2, KCl, dNTP, amorces, ADN matrice ou ADN polymérase. Cependant, la mauvaise concentration de ces réactifs peut conduire à des résultats erronés, diminuant la rigueur de la réaction. Lors du dépannage de la PCR, un seul réactif doit être manipulé à la fois. Cependant, il peut être prudent de titrer le réactif manipulé.

Sel de magnésium Mg 2+ (concentration réactionnelle finale de 0,5 à 5,0 mM) Les ADN polymérases thermostables nécessitent la présence de magnésium pour agir comme cofacteur pendant le processus de réaction. La modification de la concentration en magnésium est l'un des réactifs les plus faciles à manipuler avec peut-être le plus grand impact sur la rigueur de la PCR. En général, le rendement du produit PCR augmentera avec l'ajout de plus grandes concentrations de Mg 2+ . Cependant, des concentrations accrues de Mg 2+ diminueront également la spécificité et la fidélité de l'ADN polymérase. La plupart des fabricants incluent une solution de chlorure de magnésium (MgCl2) avec l'ADN polymérase et une solution tampon PCR 10X. Les solutions tampons 10 X PCR peuvent contenir 15 mM de MgCl2, ce qui est suffisant pour une réaction PCR typique, ou il peut être ajouté séparément à une concentration optimisée pour une réaction particulière. Mg 2+ n'est pas réellement consommé dans la réaction, mais la réaction ne peut pas se dérouler sans qu'il soit présent. Lorsqu'il y a trop de Mg 2+ , cela peut empêcher la dénaturation complète de la matrice d'ADN en stabilisant le brin duplex. Trop de Mg 2+ peut également stabiliser l'hybridation parasite des amorces à des sites de matrice incorrects et diminuer la spécificité résultant en des produits PCR indésirables. Lorsqu'il n'y a pas assez de Mg 2+ , la réaction ne se poursuit pas, ce qui entraîne l'absence de produit de PCR.

Sel de potassium K + (concentration réactionnelle finale de 35 à 100 mM) Les produits de PCR plus longs (10 à 40 kb) bénéficient de la réduction du sel de potassium (KCl) par rapport à sa concentration réactionnelle normale de 50 mM, souvent en conjonction avec l'ajout de DMSO et/ou glycérol. Si l'amplicon souhaité est inférieur à 1000 pb et que de longs produits non spécifiques se forment, la spécificité peut être améliorée en titrant le KCl, en augmentant la concentration par incréments de 10 mM jusqu'à 100 mM. L'augmentation de la concentration en sel permet aux molécules d'ADN plus courtes de se dénaturer préférentiellement en molécules d'ADN plus longues.

Désoxynucléotide 5'-triphosphates (concentration de réaction finale de 20 et 200 μM chacun) Les désoxynucléotide 5'-triphosphates (dNTP) peuvent poser des problèmes pour la PCR s'ils ne sont pas aux concentrations équivalentes appropriées (c'est-à-dire, [A] = [T] = [C] = [G]) et/ou en raison de leur instabilité due aux congélations et décongélations répétées. La concentration habituelle de dNTP est de 50 μM de CHACUN des quatre dNTP. Cependant, la PCR peut tolérer des concentrations comprises entre 20 et 200 μM chacune. Des concentrations plus faibles de dNTP peuvent augmenter à la fois la spécificité et la fidélité de la réaction, tandis que des concentrations excessives de dNTP peuvent en fait inhiber la PCR. Cependant, pour des fragments de PCR plus longs, une concentration de dNTP plus élevée peut être requise. Un grand changement dans la concentration de dNTP peut nécessiter un changement correspondant dans la concentration de Mg 2+.

Les ADN polymérases thermiquement stables Les enzymes PCR et les tampons associés à ces enzymes ont parcouru un long chemin depuis le premier Taq L'ADN polymérase a été utilisée pour la première fois. Ainsi, le choix d'une enzyme appropriée peut être utile pour obtenir les produits d'amplicons souhaités. Par exemple l'utilisation de Taq L'ADN polymérase peut être préférée à l'ADN polymérase Pfu si la processivité et/ou l'addition d'un résidu adénine aux extrémités 3' du produit PCR est souhaitée. L'ajout d'une adénine 3' est devenu une stratégie utile pour cloner des produits de PCR dans des vecteurs TA avec des surplombs de thymine 3'. Cependant, si la fidélité est plus importante, une enzyme telle que la Pfu peut être un meilleur choix. Plusieurs fabricants ont une gamme d'ADN polymérases spécifiques conçues pour des besoins spécialisés. Jetez un œil aux conditions de réaction et aux caractéristiques de l'amplicon souhaité, puis faites correspondre l'expérience PCR avec l'ADN polymérase appropriée. La plupart des fabricants ont des tableaux qui facilitent la sélection de l'ADN polymérase en répertoriant des caractéristiques telles que la fidélité, le rendement, la vitesse, les longueurs cibles optimales et si elle est utile pour l'amplification riche en G-C ou la PCR à démarrage à chaud.

ADN modèle La qualité et la pureté de l'ADN auront un effet substantiel sur la probabilité d'une expérience PCR réussie. Les concentrations d'ADN et d'ARN peuvent être déterminées à l'aide de leurs mesures de densité optique à 260 nm (DO260). La masse d'acides nucléiques purifiés en solution est calculée à 50 μg/ml d'ADN double brin ou 40 μg/ml pour l'ARN ou l'ADN simple brin à une DO260 =1.0. Les contaminants d'extraction d'ADN sont des inhibiteurs courants en PCR et doivent être soigneusement évités. Les inhibiteurs courants de l'extraction d'ADN de la PCR comprennent les protéines, l'ARN, les solvants organiques et les détergents. Utilisation de l'absorption maximale des acides nucléiques OD260 par rapport à celle des protéines DO280 (DO260/280), il est possible de déterminer une estimation de la pureté de l'ADN extrait. Idéalement, le rapport de DO260/280 est compris entre 1,8 et 2,0. OD inférieur260/280 indique une contamination par des protéines et/ou des solvants qui, selon toute probabilité, sera problématique pour la PCR. En plus de la qualité de l'ADN matrice, l'optimisation de la quantité d'ADN peut grandement bénéficier au résultat d'une expérience PCR. Bien qu'il soit pratique de déterminer la quantité en ng/μl, qui est souvent la sortie des nanospectrophotomètres modernes, l'unité pertinente pour une expérience PCR réussie est le nombre de molécules. C'est-à-dire, combien de copies de matrice d'ADN contiennent une séquence complémentaire aux amorces de PCR ? Les molécules cibles optimales sont comprises entre 104 et 107 molécules et peuvent être calculées comme cela a été décrit dans les notes ci-dessus.

9. Réactifs additifs

Les réactifs additifs peuvent donner des résultats lorsque tout le reste échoue. Comprendre les réactifs et à quoi ils servent est essentiel pour déterminer quels réactifs peuvent être les plus efficaces dans l'acquisition du produit PCR souhaité. L'ajout de réactifs à la réaction est compliqué par le fait que la manipulation d'un réactif peut avoir un impact sur la concentration utilisable d'un autre réactif. In addition to the reagents listed below, proprietary commercially available additives are available from many biotechnology companies.

10. Additives That Benefit G-C Rich Templates

Dimethylsulfoxide (final reaction concentration of 1-10% DMSO) In PCR experiments in which the template DNA is particularly G-C rich (GC content 㹠%), adding DMSO may enhance the reaction by disrupting base pairing and effectively lowering the Tm. Some Tm calculators include a variable entry for adding the concentration of DMSO desired in the PCR experiment. However, adding more than 2% DMSO may require adding more DNA polymerase as it has been demonstrated to inhibit Taq ADN polymérase.

Formamide (final reaction concentration of 1.25-10%) Like DMSO, formamide also disrupts base pairing while increasing the stringency of primer annealing, which results in less non-specific priming and increased amplification efficiency. Formamide also has been shown to be an enhancer for G-C rich templates.

7-deaza-2'-deoxyguanosine 5'-triphosphate (final reaction concentration of dc 7 GTP 3 dc 7 GTP:1 dGTP 50 μM) Using 3 parts, or 37.5 μM, of the guanosine base analog dc 7 GTP in conjunction with 1 part, or 12.5 μM, dGTP will destabilize formation of secondary structures in the product. As the amplicon or template DNA is denatured, it will often form secondary structures such as hairpin loops. Incorporation of dc 7 GTP into the DNA amplicon will prohibit formation of these aberrant structures.

dc 7 GTP attenuates the signal of ethidium bromide staining which is why it is used in a 3:1 ratio with dGTP.

Betaine (final reaction concentration of 0.5M to 2.5M) Betaine (N,N,N-trimethylglycine) is a zwitterionic amino acid analog that reduces and may even eliminate the DNA melting temperature dependence on nucleotide composition. It is used as an additive to aid PCR amplification of G-C rich targets. Betaine is often employed in combination with DMSO and can greatly enhance the chances of amplifying target DNA with high G-C content.

11. Additives That Help PCR in the Presence of Inhibitors

Non ionic detergents function to suppress secondary structure formation and help stabilize the DNA polymerase. Non ionic detergents such as Triton X-100, Tween 20, or NP-40 may be used at reaction concentrations of 0.1 to 1% in order to increase amplicon production. However, concentrations above 1% may be inhibitory to PCR. The presence of non ionic detergents decreases PCR stringency, potentially leading to spurious product formation. However, their use will also neutralize the inhibitory affects of SDS, an occasional contaminant of DNA extraction protocols.

Addition of specific proteins such as Bovine serum albumin (BSA) used at 400 ng/μl and/ or T4 gene 32 protein at 150 ng/μl aid PCR in the presence of inhibitors such as FeCl3, hemin, fulvic acid, humic acid, tannic acids, or extracts from feces, fresh water, and marine water. However, some PCR inhibitors, including bile salts, bilirubin, EDTA, NaCl, SDS, or Triton X-100, are not alleviated by addition of either BSA or T4 gene 32 protein.

12. Modifications to Cycling Conditions

Optimizing the annealing temperature will enhance any PCR reaction and should be considered in combination with other additives and/ or along with other modifications to cycling conditions. Thus, in order to calculate the optimal annealing temperature the following equation is employed: Tune OPT = 0.3 Tm Primer + 0.7 Tm Product -14.9 Tm Primer is calculated as the Tm of the less stable pair using the equation: Tm Primer = ((ΔH/(ΔS+R x ln(c/4)))-273.15 + 16.6 log[K + ] Where ΔH is the sum of the nearest neighbor enthalpy changes for hybrids ΔS is the sum of the nearest neighbor entropy changes R is the Gas Constant (1.99 cal K-1 mol-1) C is the primer concentration and [K + ] is the potassium concentration. The latter equation can be computed using one of the Tm calculators listed at the following website: http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html Tm Product is calculated as follows: Tm Product = 0.41(%G-C) + 16.6 log [K + ] - 675/product length For most PCR reactions the concentration of potassium ([K + ]) is going to be 50 mM.

Hot start PCR is a versatile modification in which the initial denaturation time is increased dramatically (Tableau 4). This modification can be incorporated with or without other modifications to cycling conditions. Moreover, it is often used in conjunction with additives for temperamental amplicon formation. In fact, hot start PCR is increasingly included as a regular aspect of general cycling conditions. Hot start has been demonstrated to increase amplicon yield, while increasing the specificity and fidelity of the reaction. The rationale behind hot start PCR is to eliminate primer-dimer and non-specific priming that may result as a consequence of setting up the reaction below the Tm. Thus, a typical hot start reaction heats the sample to a temperature above the optimal Tm, at least to 60 ଌ before any amplification is able to occur. In general, the DNA polymerase is withheld from the reaction during the initial, elongated, denaturing time. Although other components of the reaction are sometimes omitted instead of the DNA polymerase, here we will focus on the DNA polymerase. There are several methods which allow the DNA polymerase to remain inactive or physically separated until the initial denaturation period has completed, including the use of a solid wax barrier, anti-DNA polymerase antibodies, and accessory proteins. Alternatively, the DNA polymerase may simply be added to the reaction after the initial denaturation cycle is complete.

Touchdown PCR (TD-PCR) is intended to take some of the guess work out of the Tm calculation limitations by bracketing the calculated annealing temperatures. The concept is to design two phases of cycling conditions (Tableau 5). The first phase employs successively lower annealing temperatures every second cycle (traditionally 1.0 ଌ), starting at 10 ଌ above and finishing at the calculated Tm or slightly below. Phase two utilizes the standard 3-step conditions with the annealing temperature set at 5 ଌ below the calculated Tm for another 20 to 25 cycles. The function of the first phase should alleviate mispriming, conferring a 4-fold advantage to the correct product. Thus, after 10 cycles, a 410-fold advantage would yield 4096 copies of the correct product over any spurious priming.

Stepdown PCR is similar to TD-PCR with fewer increments in the first phase of priming. As an example, the first phase lowers annealing temperatures every second cycle by 3 ଌ, starting at 10 ଌ above and finishing at 2 ଌ below the calculated Tm. Like TD-PCR, phase two utilizes the standard 3-step conditions with the annealing temperature set at 5 ଌ below the calculated Tm for another 20 to 25 cycles. This would allow the correct product a 256-fold advantage over false priming products.

Slowdown PCR is simply a modification of TD-PCR and has been successful for amplifying extremely G-C rich (above 83%) sequences (Table 6). The concept takes into account a relatively new feature associated with modern thermal cyclers, which allows adjustment of the ramp speed as well as the cooling rate. The protocol also utilizes dc 7 GTP to reduce 2 °structure formation that could inhibit the reaction. The ramp speed is lowered to 2.5 ଌ s -1 with a cooling rate of 1.5 ଌ s -1 for the annealing cycles. The first phase starts with an annealing temperature of 70 ଌ and reduces the annealing temperature by 1 ଌ every 3 rounds until it reaches 58 ଌ. The second phase then continues with an annealing temperature of 58 ଌ for an additional 15 cycles.

Nested PCR is a powerful tool used to eliminate spurious products. The use of nested primers is particularly helpful when there are several paralogous genes in a single genome or when there is low copy number of a target sequence within a heterogeneous population of orthologous sequences. The basic procedure involves two sets of primers that amplify a single region of DNA. The outer primers straddle the segment of interest and are used to generate PCR products that are often non-specific in 20 to 30 cycles. A small aliquot, usually about 5 μl from the first 50 μl reaction, is then used as the template DNA for another 20 to 30 rounds of amplification using the second set of primers that anneal to an internal location relative to the first set.

Other PCR protocols are more specialized and go beyond the scope of this paper. Examples include RACE-PCR, Multiplex-PCR, Vectorette-PCR, Quantitative-PCR, and RT-PCR.

13. Representative Results

Representative PCR results were generated by following the basic PCR protocols described above. The results incorporate several troubleshooting strategies to demonstrate the effect of various reagents and conditions on the reaction. Genes from the budding yeast Saccharomyces cerevisiae and from an uncharacterized Mycobacteriophage were amplified in these experiments. The standard 3-step PCR protocol outlined in Table 2 was employed for all three experiments described below.

Before setting up the PCR experiment, the genomic DNA from both S. cerevisiae and the Mycobacteriophage were quantified and diluted to a concentration that would allow between 10 4 and 10 7 molecules of DNA per reaction. The working stocks were prepared as follows. A genomic yeast DNA preparation yielded 10 4 ng/μl. A dilution to 10 ng/μl was generated by adding 48 μl into 452 μl of TE pH 8.0 buffer. Depuis le S. cerevisiae genome is about 12.5 Mb, 10 ng contain 7.41 X 10 5 molecules. The genomic Mycobacteriophage DNA preparation yielded 313 ng/μl. A dilution to 2 ng/μl was generated by adding 6.4 μl into 993.6 μl of TE pH 8.0 buffer. This phage DNA is about 67 Kb. Thus, 1 ng contains 2.73 X 10 7 molecules, which is at the upper limit of DNA generally used for a PCR. The working stocks were then used to generate the Master Mix solutions outlined in Table 7. Experiments varied cycling conditions as described below.

Dans Figure 3a, genomic DNA from S. cerevisiae was used as a template to amplify the GAL3 gene, which encodes a protein involved in galactose metabolism. The goal for this experiment was to determine the optimal Mg 2+ concentration for this set of reagents. No MgCl2 was present in the original PCR buffer and had to be supplemented at the concentrations indicated with a range tested from 0.0 mM to 5.0 mM. As shown in the figure, a PCR product of the expected size (2098 bp) appears starting at a Mg 2+ concentration of 2.5 mM (lane 6) with an optimal concentration at 4.0 mM (lane 9). The recommended concentration provided by the manufacturer was 1.5 mM, which is the amount provided in typical PCR buffers. Perhaps surprisingly, the necessary concentration needed for product formation in this experiment exceeded this amount.

A different DNA template was used for the experiment presented in Figure 3b. Genomic DNA from a Mycobacteriophage was used to amplify a conserved 566 bp DNA segment. Like the previous experiment, the optimal Mg 2+ concentration had to be determined. Comme représenté sur la Figure 3b, amplification of the desired PCR product requires at least 2.0 mM Mg 2+ (lane 5). While there was more variability in the amount of product formed at increasing concentrations of MgCl2, the most PCR product was observed at 4 mM Mg 2+ (lane 9), the same concentration observed for the yeast GAL3 gene.

Notice that in the experiments presented in Figures 3A and 3B, a discrete band was obtained using the cycling conditions thought to be optimal based on primer annealing temperatures. Specifically, the denaturation temperature was 95 ଌ with an annealing temperature of 61 ଌ, and the extension was carried out for 1 minute at 72 ଌ for 30 cycles. The final 5 minute extension was then done at 72 ଌ. For the third experiment presented in Figure 3c, three changes were made to the cycling conditions used to amplify the yeast GAL3 gene. First, the annealing temperature was reduced to a sub-optimal temperature of 58 ଌ. Second, the extension time was extended to 1 minute and 30 seconds. Third, the number of cycles was increased from 30 to 35 times. The purpose was to demonstrate the effects of sub-optimal amplification conditions (i.e., reducing the stringency of the reaction) on a PCR experiment. Comme représenté sur la Figure 3c, what was a discrete band in Figure 3a, becomes a smear of non-specific products under these sub-optimal cycling conditions. Furthermore, with the overall stringency of the reaction reduced, a lower amount of Mg 2+ is required to form an amplicon.

All three experiments illustrate that when Mg 2+ concentrations are too low, there is no amplicon production. These results also demonstrate that when both the cycling conditions are correctly designed and the reagents are at optimal concentrations, the PCR experiment produces a discreet amplicon corresponding to the expected size. The results show the importance of performing PCR experiments at a sufficiently high stringency (e.g., discreet bands versus a smear). Moreover, the experiments indicate that changing one parameter can influence another parameter, thus affecting the reaction outcome.

Tableau 1. PCR reagents in the order they should be added.

*Units may vary between manufacturers

** Add all reagents to the Master Mix excluding any in need of titration or that may be variable to the reaction. The Master Mix depicted in the above table is calculated for 11 reactions plus 2 extra reactions to accommodate pipette transfer loss ensuring there is enough to aliquot to each reaction tube.

 Standard 3-step PCR Cycling 
Cycle stepTempératureTempsNumber of Cycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ below Tm 70 ଌ to 80 ଌ 10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 minutes1
Prise*4 ଌ1

Table 2. Standard 3-step PCR Cycling.

* Most thermal cyclers have the ability to pause at 4ଌ indefinitely at the end of the cycles.

 2-step PCR Cycling 
Cycle stepTempératureTempsNumber of Cycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation Annealing/Extension94 ଌ 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 minutes1

Table 3. 2-step PCR Cycling.

 Hot Start PCR Cycling 
Cycle stepTempératureTempsCycles
Initial Denaturation60 ଌ to 95 ଌ5 minute then add DNA polymerase1
Denaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ below Tm 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 25-35
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 minutes1

Tableau 4. Hot Start PCR Cycling.

 Touchdown PCR Cycling 
Cycle stepTempératureTempsCycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation recuit Extension94 ଌ X =10 ଌ above Tm 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 2
Denaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ reduce 1 ଌ every other cycle 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 28
Denaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ below Tm 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and DNA polymerase dependent 20-25
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 minutes1

Tableau 5. Touchdown PCR Cycling.

 Slowdown PCR Cycling 
Cycle stepTempératureTempsCycles
Initial Denaturation94 ଌ to 98 ଌ1 minute1
Denaturation recuit Extension94 ଌ X ଌ =10 ଌ above Tm 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 2
Denaturation recuit Extension94 ଌ X-1 ଌ reduce 1 ଌ every other cycle 70 ଌ to 80 ଌ*10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 28
Denaturation recuit Extension94 ଌ 5 ଌ below Tm 70 ଌ to 80 ଌ10 to 60 seconds 30 seconds Amplicon and polymerase dependent 20-25
Final Extension70 ଌ to 80 ଌ5 minutes1

Table 6. Slowdown PCR Cycling.

*For slowdown PCR, the ramp speed is lowered to 2.5 ଌ s -1 with a cooling rate of 1.5 ଌ s -1 for the annealing cycles.

Table 7. Titration of Mg 2+ used in figure 3.

Figure 1. Common problems that arise with primers and 3-step PCR amplification of target DNA. (a) Self-annealing of primers resulting in formation of secondary hairpin loop structure. Note that primers do not always anneal at the extreme ends and may form smaller loop structures. (b) Primer annealing to each other, rather than the DNA template, creating primer dimers. Once the primers anneal to each other they will elongate to the primer ends. (c) PCR cycles generating a specific amplicon. Standard 3-step PCR cycling include denaturation of the template DNA, annealing of primers, and extension of the target DNA (amplicon) by DNA polymerase.

Figure 2. Ice bucket with reagents, pipettes, and racks required for a PCR. (1.) P-200 pipette, (2.) P-1000 pipette, (3.) P-20 pipette, (4.) P-10 pipette, (5.) 96 well plate and 0.2 ml thin walled PCR tubes, (6.) Reagents including Taq polymerase, 10X PCR buffer, MgCl2, sterile water, dNTPs, primers, and template DNA, (7.) 1.8 ml tubes and rack.

Figure 3. Example of a Mg 2+ titrations used to optimize a PCR experiment using a standard 3-step PCR protocol. (une) S. cerevisiae Yeast genomic DNA was used as a template to amplify a 2098 bp GAL3 gene. In lanes 1 - 6, where the Mg 2+ concentration is too low, there either is no product formed (lanes 1-5) or very little product formed (lane 6). Lanes 7 - 11 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR experiment as indicated by the presence of the 2098 bp amplicon product. (b) An uncharacterized mycobacteriophage genomic DNA template was used to amplify a 566 bp amplicon. Lanes 1 - 4, the Mg 2+ concentration is too low, as indicated by the absence of product. Lanes 5 - 11 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR as indicated by the presence of the 566 kb amplicon product. (c) . S. cerevisiae Yeast genomic DNA was used as a template to amplify a 2098 bp GAL3 gene as indicated in panel a. However, the annealing temperature was reduced from 61 ଌ to 58 ଌ, resulting in a non-specific PCR bands with variable lengths producing a smearing effect on the agarose gel. Lanes 1 - 4, where the Mg 2+ concentration is too low, there is no product formed. Lanes 5 - 8 represent optimal concentrations of Mg 2+ for this PCR as seen by the presence of a smear and band around the 2098 kb amplicon product size. Lanes 9 - 11 are indicative of excessively stringent conditions with no product formed. (a-c) Lanes 12 is a negative control that did not contain any template DNA. Lane M (marker) was loaded with NEB 1kb Ladder.

Figure 4. Sterile tubes used for PCR. (1.) 1.8 ml tube (2.) 0.2 ml individual thin walled PCR tube, (3.) 0.2 ml strip thin walled PCR tubes and caps.

Figure 5. Thermal cycler. Closed thermal cycler left image. Right image contains 0.2 ml thin walled PCR tubes placed in the heating block of an open thermal cycler.


Useful Links

C'est l'un des plus de 2400 cours sur OCW. Explorez les matériaux de ce cours dans les pages liées le long de la gauche.

MIT OpenCourseWare est une publication gratuite et ouverte de matériel provenant de milliers de cours du MIT, couvrant l'ensemble du programme du MIT.

Aucune inscription ni inscription. Parcourez et utilisez librement les documents OCW à votre rythme. Il n'y a pas d'inscription, ni de date de début ou de fin.

La connaissance est votre récompense. Utilisez OCW pour guider votre propre apprentissage tout au long de la vie ou pour enseigner aux autres. Nous n'offrons pas de crédit ou de certification pour l'utilisation d'OCW.

Fait pour le partage. Téléchargez des fichiers pour plus tard. Envoyez à vos amis et collègues. Modifier, remixer et réutiliser (n'oubliez pas de citer OCW comme source.)

About MIT OpenCourseWare

MIT OpenCourseWare is an online publication of materials from over 2,500 MIT courses, freely sharing knowledge with learners and educators around the world. Learn more »

© 2001&ndash2018
Massachusetts Institute of Technology

Your use of the MIT OpenCourseWare site and materials is subject to our Creative Commons License and other terms of use.


P OLYMERASE C HAIN R EACTION

Polymerase chain reaction (PCR) is a robust technique to selectively amplify a specific segment of DNA in vitro.[1] PCR is performed on thermocycler and it involves three main steps: (1) denaturation of dsDNA template at 92�ଌ, (2) annealing of primers at 50�ଌ, and (3) extension of dsDNA molecules at approx. 72ଌ. These steps are repeated for 30� cycles.

Various chemical components of PCR include MgCl2, buffer (pH: 8.3𠄸.8), Deoxynucleoside triphosphates (dNTPs), PCR primers, target DNA, and thermostable DNA polymerase.[2]

Target sequence is the sequence within the DNA template, which will be amplified by PCR.[2]

PCR primers are single-stranded DNA (usually 18� nucleotides long), which match the sequences at the ends of or within the target DNA, and these are required to start DNA synthesis in PCR.[2]


Advantages and limitations of PCR

There are multiple advantages to PCR. First, it is a simple technique to understand and to use, and it produces results rapidly (Bolognia et al, 2008). It is a highly sensitive technique with the potential to produce millions to billions of copies of a specific product for sequencing, cloning, and analysis. This is true of qRT-PCR as well, but qRT-PCR has the advantage of quantification of the synthesized product. Thus, it can be used to analyze alterations of gene expression levels in tumors, microbes, or other disease states.

Although PCR is a valuable technique, it does have limitations. Because PCR is a highly sensitive technique, any form of contamination of the sample by even trace amounts of DNA can produce misleading results (Bolognia et al, 2008 Smith & Osborn, 2009). In addition, in order to design primers for PCR, some prior sequence data is needed. Therefore, PCR can only be used to identify the presence or absence of a known pathogen or gene. Another limitation is that the primers used for PCR can anneal non-specifically to sequences that are similar, but not completely identical to target DNA. In addition, incorrect nucleotides can be incorporated into the PCR sequence by the DNA polymerase, albeit at a very low rate.


5. ELISA

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is a popular format of “wet-lab” type analytic biochemistry assay that uses a solid-phase enzyme immunoassay (EIA) to detect the presence of a substance, usually an antigen ( peptides, proteins, antibodies and hormones), in a liquid sample or wet sample.

ELISA involves the separation of specific and non-specific interactions (via serial binding to a solid surface, usually a polystyrene multi-well plate) and quantification through color change. The ELISA procedure results in a colored end product which correlates to the amount of analyte (substance under investigation) present in the original sample. Know more about ELISA.


The basics of gel electrophoresis

The purpose of gel electrophoresis or “running a gel” is to visualize whether or not your DNA extraction and/or subsequent PCR reaction actually worked. Although PCR is supposed to only amplify a single pure product, the reality is that you end up with a mix of primer-dimers (primers binding to each other instead of the template strand) and incorrect fragments in addition to your desired product. Gel electrophoresis is used to sort DNA fragments by size (number of base pairs). By comparing PCR products to a “ladder” or a set of known standard base pair lengths, you can estimate the length of the fragments from your PCR and look for one that matches the size of the product you were trying to amplify.

What you need
To do a gel electrophoresis, you will need the following items:

  1. Gel rig: this is a specialized piece of equipment for casting your gel and doing an electrophoresis.
  2. PCR product: this is the mixture of DNA fragments you want to sort.
  3. DNA ladder: a solution of DNA molecules of varying length that is used as a size reference.
  4. Buffer: this is used to make up the gel, maintains the pH, and contains the ions necessary to carry an electric charge.
  5. Agarose gel: this is a type of gelatin from seaweed that will separate the DNA fragments.
  6. Loading dye: this dye is added to the DNA sample to make it easier to handle.
  7. DNA stain: this dye binds to DNA so the bands can be seen in the transilluminator. Examples include SYBR Green, SYBR Safe, Ethidium Bromide, and Fast Blast.
  8. Transilluminator: this machine produces UV, blue, or white light which makes the DNA stain (and the DNA) glow. Different sources of light correspond to different stains.

Comment ça marche?
DNA molecules carry an overall negative charge. Since opposites attract, DNA is attracted to positive charges, in this case, the (+) electrode in the gel rig. To get to the (+) electrode, DNA has to travel through a sheet of agarose gel. Smaller pieces are able to travel through the gel faster than long pieces. Fragments of the same length travel at the same speed and form clear bands in the gel.

When the gel is finished running, it is soaked in a DNA Stain, a chemical that does two things: 1) bind to double-stranded DNA and 2) glow under UV, blue, or white light.
The resulting gel image should look something like this:

Note that there are 6 lanes on this gel. Lanes 1 and 6 contain a ladder that serves as a reference of measurement. The DNA or PCR product is in lanes 2-5 with resulting bands in lanes 2-4. Also note that the flow of electricity is from negative to positive.


Bring polymerase chain reaction (PCR) and electrophoresis into your classroom with the Taste of Genetics PTC MiniLab! This fun and engaging Mendelian genetics lab allows students to identify their phenotype for bitter taste and investigate their genotype for the bitter taste gene, TAS2R38. Students will extract their own DNA, amplify a region of interest of the gene, use a restriction digest assay to cut the DNA, then separate and visualize the fragments using electrophoresis to determine their genetic profile of the of their TAS2R38 alleles.

  • Teacher guide with background information, step-by-step procedures, questions for critical thinking, and sample answers for teachers
  • Hands-on lab that can be completed in three 50-minute class periods
  • Store at 4°C GreenGel™ Cups should be left in the original box and protected from light
  • Guaranteed stable for three months with proper storage

Teaching AP Biology? A Taste of Genetics MiniLab and extension activities are three Big Ideas in one comprehensive package. Together, these labs are an in-depth exploration of the TAS2R38 gene, covering hands-on genetic analysis, bioinformatics, population genetics, and evolution.

Materials Included in each MiniLab:

Each MiniLab contains enough materials for 10 workstations, 2 – 3 students per workstation.

  • Ten 2% Agarose GreenGel™ Cups
  • One bottle of 100 mL TBE buffer concentrate, enough to make 2L of 1X running buffer
  • DNA extraction solution
  • Forward and reverse primers for PTC genes
  • Taq polymerase master mix (2X)
  • HaeIII restriction enzyme
  • Restriction enzyme dilution buffer
  • MiniOne® Sample Loading Dye (5X)
  • MiniOne® Molecular Weight Marker
  • One bag of 0.2mL thin-walled PCR tubes
  • One bag of 0.65 mL microcentrifuge tubes
  • Forty PTC taste strips
  • Teacher guide

8.5: Lab Procedures- PCR and Gel Electrophoresis - Biology

This inexpensive, safe, equipment was developed by the NCBE so that school students could carry out gel electrophoresis with DNA and proteins. It was awarded the coveted Millennium Product status by the Design Council in 2000.

ABOUT GEL ELECTROPHORESIS

Gel electrophoresis is a key technique in modern biology that features in all the new A Level Biology specifications in England. It is a way of separating DNA, RNA or proteins based on their size and the electrical charge on the molecules.

Comment ça fonctionne
First, a gel is cast from agarose a very pure form of agar, which is obtained from seaweed. At one end of the slab of gel are several small wells, made by the teeth of a comb that was placed in the molten agarose before it set. A buffer solution is poured over the gel, so that it fills the wells and makes contact with the electrodes at each end of the gel. Ions in the buffer solution conduct electricity. The test samples (DNA fragments) are mixed with a small volume of loading dye. This dye is dissolved in a dense sugar solution, so that when it is added to the wells, it sinks to the bottom, taking the sample with it. An electrical potential is applied across the gel. Phosphate groups give the DNA fragments a negative electrical charge, so that the DNA migrates through the gel towards the positive electrode. Small DNA fragments or proteins move quickly through the porous gel larger molecules travel more slowly. In this way the pieces of DNA or proteins are separated by size. The loading dye also moves through the gel, so that the progress of the electrophoresis can be seen (the DNA itself is invisible).

Electrophoresis kits and related items

The NCBE currently supplies four different practical protocols for gel electrophoresis.

ELECTROPHORESIS KITS

Related equipment

OTHER ITEMS

GENERAL SAFETY ADVICE

Visualising DNA
After electrophoresis, the DNA is visualised. In research laboratories, a fluorescent dye will have been incorporated into the agarose gel before it was cast. After the gel has been ‘run’ it is illuminated with ultraviolet (UV) light and the dye, which binds to DNA, will show up as bright fluorescent bands. Ethidium bromide is a dye that until recently was most commonly used for staining DNA. Ethidium bromide and its breakdown products are thought to be potent mutagens and carcinogens and therefore it should not be used in schools . Ethidium bromide has similar dimensions to a base pair in DNA. When ethidium bromide binds to DNA, it slips between adjacent base pairs and stretches the double helix. This explains the dye’s mutagenic effect — the ‘extra bases’ cause errors (frameshift mutations) when the DNA replicates. In addition, short-wavelength UV light (which itself is harmful) is required for ethidium bromide to fluoresce and reveal the DNA. For reasons of safety and because UV light of this wavelength causes unwanted mutations in the DNA being studied, several alternative stains are now commonly used in labs. Ceux-ci inclus SYBRsafe et GelRed , which although they are thought to be safer than ethidium bromide, are far more expensive [Ethidium bromide costs £4.50 per mL compared with £133 per mL for SYBRsafe and £200 per mL for GelRed (2016 prices).]

In schools, safer, cheaper dye solutions are used to stain the entire gel after electrophoresis. Suitable stains include Azure A and Azure B, Toluidine blue O and Nile blue sulphate. This type of stain is not thought to intercalate within the DNA double helix, but instead binds ionically to the negatively-charged phosphate groups of the DNA.

Polyacrylamide gels and protein electrophoresis
If you wish to separate very small DNA molecules or proteins, gels cast from polyacrylamide are sometimes used. Note: For safety reasons, polyacrylamide gels should not be cast in schools: the acrylamide use to make the gels is a neurotoxin. (You can use pre-cast gels if you wish, but they have a limited shelf life.)

It is possible to separate proteins using a special type of agarose, but in contrast to the procedure using polyacryamide, the proteins are separated by charge only (not charge and size). This is because the pores within the agarose gel are relatively large and the proteins can easily pass through them.

As with DNA, the proteins on the gel are stained with an appropriate dye such as Coomassie blue.

UNIQUE, AWARD-WINNING, SAFE, TECHNOLOGY

The enzymes and DNA in the NCBE's award-winning kits are dried. These reagents can be transported and stored at room temperature instead of the -20 °C that is normally required for such delicate biological molecules. To dispense small volumes of reagents with the required precision, the NCBE has coupled special microsyringes with calibrated tips, providing a low-cost yet highly accurate alternative to conventional micropipettes. The NCBE's gel electrophoresis apparatus uses carbon fibre electrodes rather than the platinum that is normally used. The equipment is powered by low-voltage batteries or an inexpensive, safe and effective 36 volt mains transformer. To stain the DNA on the gel the kits use Toluidine Blue O in preference to fluorescent stains and ultraviolet light. If a special agarose is used, proteins can also be separated using this equipment and stained with Colloidal Coomassie Blue.

THE POLYMERASE CHAIN REACTION

The polymerase chain reaction (PCR) is one of the most important and powerful methods in molecular biology. It enables millions of copies of specific DNA sequences to be made easily and quickly. The technique and variations of it are used extensively in medicine, in molecular genetics and in pure research. The PCR and plant evolution module provides materials for the simple extraction of chloroplast DNA from plant tissue, its amplification by the PCR, and gel electrophoresis of the PCR product. Students can use plants of their choice and identify possible evolutionary relationships between different species. This mirrors the molecular methods used in modern plant taxonomy. This activity presents an ideal opportunity for open-ended investigations by individual students or groups.


Voir la vidéo: Electrophorèse en gel (Août 2022).