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Vecteurs pour le génie génétique

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Eh bien, une bactérie peut-elle être utilisée comme vecteur ? J'ai appris que Agrobacterium tumifacian peut être utilisé pour délivrer un gène d'intérêt dans des cellules végétales, mais dans un livre dans une question à choix multiples, il est dit que seuls le plasmide et le bactériophage peuvent être utilisés et non les bactéries pour délivrer un gène d'intérêt à une cellule hôte.


Oui, Agrobacterium est en effet un vecteur très largement utilisé chez les plantes. Il ne serait donc pas faux de considérer les bactéries comme des vecteurs. Juste pour ajouter, il convient de noter que ces derniers temps, des options de vecteurs bactériens ont été explorées dans le cas des humains également, en particulier dans le cas de la thérapie génique pour le traitement du cancer, bien que son succès n'ait pas encore été démontré. Consultez https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3056088/ pour plus d'informations à ce sujet.

Pour conclure, la bactérie peut être considérée comme un vecteur sans aucun doute.


Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes sont des souches bactériennes phytopathogènes du sol contenant un plasmide. Ce plasmide est connu sous le nom de plasmide Ti et est responsable de l'induction d'une tumeur. Une partie de ce plasmide appelé ADN-T peut être intégrée dans les chromosomes de l'hôte. Ainsi, ce plasmide bactérien agit comme vecteur, mais pas la cellule bactérienne entière.

(Via : https://www.sciencedirect.com/topics/agricultural-and-biological-sciences/agrobacterium-tumefaciens)

Cela est vrai avec toutes les souches bactériennes pathogènes, car elles peuvent transférer leur matériel d'ADN pour provoquer une pathogénicité. Ainsi, ces souches pathogènes peuvent être utilisées en génie génétique pour transférer un gène particulier à une cellule hôte/mammifère. L'utilisation de bactéries comme vecteur pour traiter le cancer ou diverses autres conditions pathologiques est encore au stade de développement.

(Via : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3056088/ https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16362987/)


L'erreur conceptuelle que vous faites est qu'Agrobacterium Tumifaciens, étant une bactérie, contient du matériel génétique supplémentaire dans sa cellule, appelé le « plasmide Ti ». Par conséquent, il est tout à fait justifié que le plasmide au sein de la bactérie agisse comme un vecteur, ou un porteur d'un gène étranger et non la bactérie entière elle-même.

Par conséquent, la réponse fournie dans le livre est correcte.


Vecteurs pour le génie génétique des corynébactéries

Corynebacterium glutamicum et les espèces apparentées sont des micro-organismes d'importance biotechnologique. Ces bactéries sont utilisées depuis longtemps pour la production de produits chimiques fins tels que les acides aminés et les acides organiques. De plus, elles ont été récemment envisagées pour la production de protéines xénogéniques, telles que des protéines de Mycobactéries d'importance médicale, étant donné la relation phylogénétique relativement étroite qui existe entre ces deux genres. Dans cet article, nous passons en revue divers outils moléculaires disponibles pour manipuler les corynebactéries, fournir des informations sur les séquences d'ADN sur plusieurs vecteurs utiles et rendre compte de nouveaux vecteurs navettes pour le génie génétique de ces organismes. En particulier, cette série de nouveaux plasmides permet d'utiliser la résistance au chloramphénicol, à la kanamycine, à la gentamycine ou à la spectinomycine pour une sélection positive chez les corynebactéries. Ces vecteurs complètent les divers outils de biologie moléculaire disponibles pour concevoir ces importants bioconvertisseurs et ouvrent ainsi la voie à leurs applications industrielles accrues. De plus, nous présentons des preuves corroborant l'opinion selon laquelle le plasmide pB Y503 de B. stationis appartient à une nouvelle famille de plasmides en cercle tournant comprenant pNG2 isolé de C. diphtheriae.

© 2004 Société chimique américaine

Corynebacterium glutamicum est une bactérie à Gram positif avec une teneur en GC modérément élevée. C'est un organisme qui a une longue histoire d'utilisation en biotechnologie pour la production d'acides aminés, qui représentent pour les seuls additifs alimentaires pour animaux un marché mondial de plus de 2 milliards de dollars (1-3). De plus, le potentiel des corynébactéries pour la production de protéines xénogéniques semble prometteur (4). Le séquençage récent de son génome complet facilitera l'ingénierie génétique de cet important bioconvertisseur, par exemple en permettant l'ingénierie rationnelle (5) comme outil complémentaire à la mutagenèse sur cellules entières classique ou au remaniement génomique (6). Les nombreuses souches isolées en tant qu'organismes producteurs de glutamate constituent des espèces de C. glutamicum (7) qui, dans le groupe Corynebacterium-Mycobacterium-Nocardia, sont étroitement apparentées à C. acétoacidophilum, C. callunae et G ammoniagenes. Les espèces cliniques les plus étroitement apparentées sont C. minutissimum, C. striatum et C. xerosis (8, 9).

Des outils génétiques ont été développés pour manipuler les bactéries corynéformes productrices d'acides aminés. Par exemple, des protocoles d'électroporation qui permettent la transformation efficace de cellules corynébactériennes avec une efficacité élevée ont été rapportés par plusieurs groupes (10-14). Un tel protocole a également été développé afin de concevoir G glutamicum R, une souche qui présente plusieurs caractéristiques biotechnologiques utiles, notamment la capacité de se développer sur l'éthanol comme seule source de carbone, l'absence d'autolyse dans des conditions de famine et un taux de croissance rapide. En utilisant le protocole décrit par Kurusu et al. (75), les cellules de C. glutamicum R ont été transformées avec succès à une efficacité d'environ 104 transformants par ug d'ADN. Typiquement, dans cette procédure, les cellules en phase logarithmique médiane ont été préparées pour l'électroporation par incubation avec de la pénicilline G comme moyen d'affaiblir la paroi cellulaire. Il a été démontré qu'une barrière majeure à l'électroporation était la barrière de restriction, qui est due, chez C. glutamicum MJ233C, à un système de restriction de type mrr et à un système de type mcr dans C. glutamicum ATCC 31831. D'autre part, aucun système de ce type n'a pu être identifié chez C. glutamicum ATCC 13869 (16). Lorsque l'ADN plasmidique a été isolé à partir de cellules corynéformes, ou à partir d'un mutant dam dem E. coli tel que la souche JM110 (17), des efficacités de transformation jusqu'à 4,0 x 107 transformants par ADN jig étaient typiquement atteintes (16).

La conjugaison est un protocole alternatif qui a été développé par plusieurs chercheurs (18-21) car un transfert d'ADN plasmidique conjugatif a été observé entre des bactéries Gram-positives et Gram-négatives (22). Le succès de la conjugaison comme méthode de transfert de gènes s'explique également par le constat qu'elle permet de contourner, dans une certaine mesure, la barrière de restriction. Schäfer et al. (20) et van der Rest et al. (14) ont en outre utilisé l'exposition au stress, une méthode bien décrite pour inactiver temporairement la barrière de restriction, comme moyen d'augmenter les fréquences de conjugaison.

L'avènement de ces techniques de transformation efficaces a permis l'utilisation d'ADN plasmidique intégratif afin d'effectuer une perturbation et un remplacement de gènes dans ce groupe d'importants producteurs d'acides aminés (23). Beaucoup de ces protocoles reposent sur le transfert conjugatif de plasmides portant uniquement une origine de réplication E. coli. Un protocole basé sur l'électroporation a été développé pour C. glutamicum MJ233C.

Ces dernières années, plusieurs vecteurs de clonage utiles, conçus autour de plasmides endogènes (25), ont été construits, y compris des vecteurs navettes d'expression génique (21, 26-29). Nous avons précédemment rapporté sur pBY503, un plasmide cryptique de 16,4 kb de Brevibacterium stationis (30) et la fonction de partition associée (5/), le plasmide pPROBE17, un vecteur de sonde promoteur (52), pMV5, un vecteur piège à transposon (33) basé sur le phénotype létal conféré par le gène sacB de B. subtilis (34) et pMVl 1 (Tn3/83/) et pMV23 (mi niTni/&?/), deux véhicules de délivrance d'éléments mobiles (35).

Nous rapportons dans cet article sur la construction de nouveaux vecteurs navette pour la manipulation de C. glutamicum.

Matériels et méthodes Souches bactériennes et conditions de culture

E. co/i JM109 (/7), E. co/i JM110 (/7) et C. glutamicum R, une souche sans plasmide de la collection du laboratoire, ont été utilisés dans cette étude. Les plasmides pBLl et pMVS provenaient de la collection du laboratoire. Les plasmides pHSG299 et pHSG398 ont été obtenus auprès de Takara (Osaka, Japon). Les souches d'E. coli ont été cultivées à 37°C dans du milieu LB additionné de SO pg-mT1 d'ampicilline, 50 pg.ml'1 de chloramphénicol, 50 fig ml'1 de kanamycine, 10 figue ml" de gentamycine ou 200 figue ml"1 de spectinomycine selon le cas. Les corynebactéries ont été cultivées en routine à 33°C dans du milieu AR (15). De la kanamycine, du chloramphénicol, de la gentamycine et de la spectinomycine ont été ajoutés comme il convient (50 fig ml*', 5 fig ml", 10 fig ml" et 200 fig ml*1, respectivement).

Techniques d'ADN

L'ADN chromosomique a été isolé en utilisant le kit Genomic Prep Amersham Pharmacia Biotech (UK). L'ADN plasmidique a été isolé par la procédure de lyse alcaline (36). Les endonucléases de restriction, le fragment de Klenow et l'ADN ligase T4 ont été obtenus auprès de Takara (Osaka, Japon) et utilisés conformément aux instructions du fabricant. Des fragments de restriction ont été isolés au besoin à partir de gels d'agarose avec la matrice Prep-a-Gene (Bio-Rad, Richmond, CA) selon les instructions du fabricant. Toutes les PCR ont été réalisées dans un Applied Biosystems GenAmp System 9700 tel que recommandé par le fabricant en utilisant le protocole d'amplification suivant : 30 cycles à des températures de 95°C pour la dénaturation (1 min), 54°C pour l'annelage (1 min) et 72 °C pour l'allongement (1 min).

Transformation des cellules bactériennes

Les corynebactéries ont été transformées par électroporation (16) en utilisant de l'ADN plasmidique purifié à partir de E. coli JM110. Les souches d'E. coli ont été transformées par la méthode CaClj (36).

Séquençage ADN

Nous avons généré une bibliothèque des fragments d'ADN à séquencer à l'aide d'un sonicateur Misonics (Farmingdale, NY) sur le réglage de puissance 1. Le tube Eppendorf contenant l'échantillon d'ADN a été placé dans un bain de glace et 8 cycles de sonication pendant 1 sec interrompus par 1 des intervalles secs ont été effectués. Les fragments aléatoires résultants ont été séparés par taille sur un gel d'agarose à 1 % et la fraction correspondant au pool de 2-3 kb a ensuite été purifiée du gel. Les fragments ont été rendus francs par traitement avec le fragment de Klenow et ligaturés à l'ADN plasmidique pUCl 19 digéré par Emal (obtenu auprès de Takara). Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer E. coli JM109, les recombinants ont été sélectionnés sur des plaques supplémentées en IPTG (36). A des fins de séquençage, les clones ont été cultivés pendant une nuit dans des plaques de microtitrage à 96 puits profonds dans 1 ml de milieu 2X-LB en utilisant un TAITEC Bioshaker. Les plasmides correspondants ont été isolés dans des plaques à 96 puits en utilisant le kit Millipore Montage Plasmid Miniprep96 et un robot de pipetage simple au format 96 puits Cosmotec HT Station 500 (Tokyo, Japon). La banque de plasmides ainsi générée a été séquencée aux deux extrémités en utilisant des amorces directes et inverses universelles M13 (36) et un séquençage cyclique en utilisant la méthode BigDye de ABI Biosystem Inc. dans un séquenceur ABI 3700 CE. Le système Applied Biosystems GeneAmp 9700 a été utilisé pour les réactions en chaîne par polymérase comme décrit dans la section Techniques d'ADN. Avant le séquençage, les produits de PCR résultants ont été traités avec une exonucléase en utilisant l'ExoSAP-IT d'USB (Cleveland, OH, USA) pour détruire les amorces restantes.

Les séquences d'ADN ont été analysées comme suit. Les fichiers de chromatogramme brut (fichiers .abi) ont été collectés sur un ordinateur personnel fonctionnant sous Windows 2000 (Microsoft Corp.). Les fichiers de chromatogramme ont ensuite été transférés sur un ordinateur SunBlade 1000 (Sun) avec un processeur UltraSparc-III 900 MHz 64 bits, 2 Go de mémoire. Le programme PREGAP4 du package Staden (37,38) a été utilisé pour le découpage des séquences vectorielles, ainsi que pour le découpage de qualité et le criblage de contamination après appel de base par PHRED (39, 40). Les recherches BLASTX ont été effectuées sur l'ordinateur Sun en utilisant le programme autonome BLAST (41) de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) en utilisant la matrice BLOSUM62 (42).

Numéro d'accession du nucléotide

Les séquences nucléotidiques rapportées dans cet article apparaissent dans les bases de données de séquences nucléotidiques EMBL et GenBank sous les numéros d'accès AY211882 (pCRAl) et AY211883 (pMV5).

Construction du vecteur navette pCRAl E. coli-C. glutamicum

Le plasmide pCRAl est un vecteur idéal pour une expression de haut niveau néanmoins, en raison de son mode de réplication, une instabilité ségrégationnelle et structurelle peut être observée (49, 50), en particulier lors de la surexpression de gènes dont les activités sont délétères pour la souche hôte. Pour cloner de tels gènes, les plasmides qui se répliquent via un mécanisme 0 offrent un net avantage car ces plasmides bénéficient généralement d'une stabilité structurelle et ségrégationnelle plus élevée (50).

DraX 1653 Balle 1661 Nco 1697

DraX 1653 Balle 1661 Nco 1697

Figure I. La carte physique et génétique du vecteur navette E. coli - C. glutamicum pCRA I. Seuls les sites qui sont soit uniques soit présents en deux exemplaires sont indiqués. Les flèches donnent le sens de la transcription. Le promoteur lac est représenté par pLAC, l'origine de réplication codant pour le gène codant pour la protéine par ori et le gène de résistance au chloramphénicol par Cmr. MCS : site de clonage multiple, l'ordre des sites de restriction est donné dans le sens horaire dans la case. Les nombres donnés pour chaque site sont des coordonnées.

10 Joint 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120

250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360

370 380 390 400 410 420 430 440 450 460 470 480

EcoRI SacI Kpnl XhoIBglll PstI SmalBamHI Voile PshAI

490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600

610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720

Figure 2. Séquence d'ADN du polylinker de pCRA I et de ses régions flanquantes. Le promoteur lac est indiqué en caractères gras. Cmr : résistance au chloramphénicol, Km : résistance à la kanamycine, Gmr : résistance à la gentamycine, Spec : résistance à la spectinomycine. Les différents sites de restriction dans les polylinkers sont indiqués dans le sens des aiguilles d'une montre dans les cases adjacentes à chaque plasmide avec les coordonnées.

La navette pCRB E. coli - Série de vecteurs navette Corynebacterium

La conception utilisée pour construire le vecteur pCRAl a été optimisée afin de générer une série de vecteurs navettes polyvalents permettant un clonage rapide à l'aide de lacZa. complémentation dans E. coli et une variété de marqueurs sélectionnables positivement (chloramphénicol, kanamycine, gentamycine ou spectinomycine). Les cartes de restriction et les cartes génétiques de ces vecteurs, pCRBl, pCRB2, pCRB3 et pCRB4, sont présentées sur la figure 3.

Le plasmide pCRB 1 a été construit comme suit. Les amorces 2 et 3 (respectivement CTC TGA TAT QGT TCC ACT GAG CGT CAG ACC, CTC TGA TAT CTC CGT CGA ACG GAA GAT CAC les bases correspondant aux sites de restriction utilisés dans le clonage ont été soulignées) ont été utilisées pour amplifier par PCR l'ensemble du pHSG398 plasmide. L'amplicon résultant a été digéré avec EcoRV et ligaturé à l'ADN plasmidique pBLl linéarisé par Hpal. Le mélange de ligature a été utilisé pour transformer E. coli et l'un des clones résultants a été sélectionné au hasard comme source d'ADN plasmidique pCRBl, qui a une taille de 4 050 pb.

Le plasmide pCRB2 a été construit par linéarisation de l'ADN du plasmide pHSG299 en utilisant Sfal et ligature à un fragment PCR digéré par Hpal codant pour l'origine de réplication du plasmide pBLl. Ce fragment a été généré en utilisant les oligonucléotides CTC TGT TAA CACA TGC AGT CAT GTC GTG CT et CTC TGJ TAA CAC AAC AAG ACC CAT CAT AGT. Le plasmide résultant a une taille de 4 494 pb.

Le gène de résistance à la gentamicine (51) était disponible sur une cartouche EcoRI clonée dans le plasmide pGP704Gm (52). L'ADN du plasmide pCRBl a été utilisé comme matrice pour amplifier par PCR un amplicon dépourvu du marqueur de résistance au chloramphénicol, en utilisant les amorces 1 et 5 (respectivement CTC TGA TAT CCA ATA CGC AAA CCG CCT CTC et CTC JGJ TAA CAC AAC AAG ACC CAT CAT AGT) . Le produit de PCR résultant a été digéré avec EcoRV et Hpal et ligaturé à l'ADN plasmidique pGP704Gm linéarisé par Dra pour donner le plasmide pCRB3, d'une taille de 4 729 pb, récupéré à partir d'une colonie d'E. coli obtenue après transformation de cellules HBlOl E. coli.

Le vecteur navette de résistance à la spectinomycine de 4 155 pb pCRB4 a été construit en ligaturant la cassette de résistance à la spectinomycine Xba-Nde disponible sur le plasmide pMV5 (33) à un amplicon pCRB 1 dépourvu du marqueur chloramphénicol et obtenu comme décrit ci-dessus. Le fragment Xba-Nde a été rendu franc par traitement avec le fragment de Klenow et ligaturé au produit de PCR décrit ci-dessus digéré avec EcoRV-Hpal.

Les séquences complètes de ces quatre nouveaux vecteurs ont été assemblées in silico sur la base des informations de séquence disponibles dans les bases de données publiques.

Le vecteur piège à transposon pMV5

L'expression de la sucrase de B. subtilis levan (53, 54) s'est avérée létale pour les bactéries corynéformes lorsque ces cellules sont cultivées sur un milieu minimum supplémenté avec 10 % de saccharose (33, 34).

Figure 3. Les cartes physiques et génétiques des vecteurs navettes E. coli - C. glutamicum pCRBl, pCRB2, pCRB3 et pCRB4. Seuls les sites qui sont soit uniques, soit présents en deux exemplaires sont indiqués. Les flèches indiquent le sens de la transcription. Les nombres donnés pour chaque site sont des coordonnées.

Le plasmide pMV5 a été construit pour permettre la sélection positive d'événements de recombinaison de remplacement chez les corynébactéries. De plus, ce vecteur peut s'avérer utile pour le clonage d'éléments génétiques mobiles d'espèces étroitement apparentées telles que Rhodococcus ou Mycobacterium. La construction du piège à transposon pMV5 a été rapportée ailleurs (J J). Ce vecteur est basé sur l'origine de réplication du plasmide pB YS03, un épisome cryptique à faible nombre de copies de 16,2 kb provenant de Brevibacterium stationis IFO 12144 (31,44).

La séquence nucléotidique de l'origine de réplication du plasmide pBY503 (numéro d'accès GenBank AY211883) a été déterminée en utilisant le fragment correspondant porté par le plasmide pMV5. Ce fragment code pour un long cadre de lecture ouvert de 1 488 pb dont le produit partage 79% de similitude et 65% d'identité avec la protéine RepA des plasmides de C. diphtheriae pSV5 (numéro d'accession Genbank X57320), pNGA2 (AY061891) et pNG2 (AF492560), 73 % de similitude et 61 % d'identité avec le plasmide pTET3 de C. glutamicum (55), 73 % de similitude et 60 % d'identité avec le plasmide efficace de C. pCE2 (AP005225), et 66 % de similitude et 51 % d'identité avec le plasmide Cjeikeium pB85766 ( AF486522). Alors que la taille du plasmide pBY503 et son faible nombre de copies de 4,6 par équivalent chromosomique dans C. glutamicum MJ233C (31) sont des caractéristiques typiques des plasmides qui se répliquent via un mécanisme 0 (50), ces homologies observées suggèrent que pBY503 appartient à un famille de plasmides comprenant des membres dont il a été démontré qu'ils se répliquent via le mode cercle roulant (56). Cette famille de plasmides ainsi représentée par pGAl (57), pSRI (58), pNG2, pNGA2, pSV5, pCE2, pB85766 et pBY503 apparaît distincte de la famille des plasmides en cercle tournant provenant de staphylocoques, streptocoques ou lactocoques (59). L'opinion selon laquelle pBY503 ne se réplique pas via un mécanisme 0 est corroborée par l'observation qu'aucun itéron typique (60) n'a pu être trouvé en amont du gène repA.De plus, un motif conservé typique des protéines Rep codées par des plasmides et des virus à cercle roulant (61), uxxYuxKxxx (où u représente un résidu hydrophobe volumineux tel que I, L, V, M, F, Y ou W), est observé dans la protéine RepA de pBY503 (tableau 1), à l'exception notable que le résidu K est remplacé par Q. L'observation qu'en plus de pBY503, des séquences similaires sont présentes dans pTET3, pNG2, pNGA2 et pSV5 suggère que Q représente un résidu canonique à cette position particulière. De même, il est à noter que cette famille de plasmides semble caractérisée par la séquence VRGYV. L'analyse de la séquence révèle en outre un cadre de lecture ouvert supplémentaire incomplet, OrfX, situé en aval de repA dont le produit du gène présente une terminaison carboxy qui montre de fortes homologies avec les protéines de transport : 80% de similarité avec une protéine hypothétique conservée de C. efficient YS-3I4, 78 % à une perméase putative de C. glutamicum ATCC 13032 et 71 % à une protéine de transport transmembranaire putative de Streptomyces coelicolor A3 (2).

Discussion

Le génie génétique des bactéries corynéformes, et en particulier de C. glutamicum R, a été facilité par les développements récents des outils de biologie moléculaire et de la connaissance de la séquence d'ADN de ses

Tableau 1. Motif de signature RepA des plasmides en cercle roulant

Motif uxxYuxKxxx hôte de plasmides

Tableau 1. Motif de signature RepA des plasmides en cercle roulant

chromosome (Yukawa et al., non publié). Nous décrivons dans ce rapport la construction d'E. coli -C polyvalents. des vecteurs navettes glutamicum basés sur l'origine de réplication du plasmide pBLl, un épisome à grand nombre de copies isolé de diverses souches de corynébactéries et dont le mécanisme de réplication implique des cercles roulants (47, 48). Ces vecteurs permettent la complémentation lacZa dans E. coli. De plus, ils portent un site de clonage multiple dans ce dernier gène afin de faciliter le clonage. Les quatre marqueurs de résistance différents qui caractérisent cette nouvelle série de vecteurs navettes, à savoir le chloramphénicol, la kanamycine, la spectinomycine et la gentamycine, fournissent des outils de biologie moléculaire polyvalents. Ces vecteurs complètent l'ensemble des outils de biologie moléculaire existants pour la manipulation génétique de ces bactéries, des outils qui incluent des promoteurs d'un large éventail de forces et de spécificités, ainsi que des systèmes de mutagenèse par transposon. En outre, nous présentons des preuves que le plasmide pBY503 (JO) de B. stationis appartient à la famille distincte de plasmides comprenant pGAl (57), pSRl (5J), pNG2 (GenBank numéro d'accès AF492560), pNGA2 (AY061891), pSV5 (X57320 ), pCE2 (AP005225) et pB85766 (AF486522). Il est à noter que le pNG2

Il a été démontré que le mini-dérivé pEP2 se réplique via un mécanisme de cercle roulant (56). Bien que les observations disponibles promeuvent fortement l'idée que tous ces plasmides se répliquent de manière similaire, il serait intéressant d'identifier les origines simple brin et double brin (50, 62) de ces autres plasmides en utilisant des dérivés de délétion, et de démontrer qu'ils se répliquent également via un mécanisme similaire à celui du pNG2. Fait intéressant, la fonction de partition présente dans pBY503 est un élément à action cis qui n'agit pas en augmentant le nombre de copies de plasmide (5/), contrairement à l'élément à action frwu récemment identifié dans pGAl, qui favorise un nombre de copies aussi élevé que 35 copies. par équivalent chromosomique (57).

L'ingénierie des corynébactéries est d'une importance biotechnologique pour la production d'une variété de composés. Par exemple, notre groupe a réussi à produire à l'échelle industrielle de nombreux acides aminés par fermentation, dont par exemple l'acide L-aspartique (05), la L-isoleucine (64, 65) et la L-valine (65). Nous avons précédemment décrit un nouveau procédé industriel pour la production de ces acides aminés. Ce processus se caractérise par l'utilisation de cellules intactes de C. glutamicum dans des conditions de division cellulaire réprimée, et repose sur une combinaison de réutilisation des cellules et de récupération de produit comme moyen d'optimiser le ratio de substrats transformés en produits utiles en contournant le puits de l'énergie dans les cycles cellulaires ménagers et la production de biomasse. Dans nos mains, les cellules pourraient être réutilisées jusqu'à un minimum de 30 fois (Fig. 4). Ce schéma est rendu possible principalement par la propriété intrinsèque de C. glutamicum R qui ne subit pas d'autolyse dans des conditions de famine. De plus, diverses méthodes peuvent être appliquées pour limiter la formation de sous-produits, comme le traitement thermique préalable des cellules afin d'inactiver les réactions enzymatiques indésirables (65), ou l'ajout de réactifs particuliers (64).

Ce processus est peut-être mieux illustré par le schéma que nous avons utilisé pour la production d'acide L-aspartique (63). La souche MJ233 de C. glutamicum (Brevibacterium flavum) est un isolat naturel qui présente une forte activité aspartase. Profitant de cette propriété, la conversion stoechiométrique du fumarate en aspartate a été obtenue par inactivation thermique de la fumarase, l'enzyme à l'origine de la formation de sous-produit (acide malique). Des traitements thermiques de 5 à 9 h à 45 °C ou de 2 h à 50 °C se sont avérés optimaux pour obtenir une diminution de 90 % de l'activité de la fiimarase. De plus, les ions calcium étaient les seuls ions métalliques divalents capables d'activer l'aspartase de C. glutamicum MJ233, et l'ajout de 0,08 % poids/volume du détergent Tween 20 (monolaurate de poly-oxyéthylène sorbitane) a été observé pour augmenter l'activité de l'aspartase jusqu'à 40 %, vraisemblablement via une augmentation de la perméabilité cellulaire. De même, l'acide L-aspartique à une concentration minimale de 0,6 M s'est avéré protéger l'aspartase pendant le traitement thermique. Sur la base de ces connaissances empiriques et de considérations économiques ou opérationnelles, le procédé industriel de production d'acide aspartique a été conçu comme un procédé multiphase. La première phase comprend une étape de culture pour générer de la biomasse et une étape de pré-réaction pour concevoir sur mesure le pool d'enzymes intracellulaires. L'étape de génération de biomasse est réalisée en conditions aérobies à 33°C pendant 30 h dans un milieu pH 7,6 constitué de 2,3% (NHUfcSO* 0,05% K2HP04, 0,05% KH2P04, 0,05% MgS04.7H20, 0,3% extrait de levure, 0,3% casamino acides, 200 ppb biotine, 100 ppb

Figure 4. Le processus de réaction des cellules vivantes. Ce procédé est caractérisé par l'utilisation d'une souche de production bactérienne qui ne subit pas d'autolyse dans des conditions de non-croissance. Cette propriété rend l'immobilisation inutile et permet l'utilisation d'équipements de fermentation standard. De plus, le taux d'utilisation du carbone pour la production de produits est maximisé à mesure que la croissance végétative et les fonctions d'entretien ménager sont minimisées. La séparation du produit du mélange réactionnel et le recyclage des cellules sont effectués à l'aide d'un appareil d'ultrafiltration. La purification des produits sécrétés tels que les acides aminés est facilitée par la contamination négligeable des matériaux intracellulaires. De plus, des températures et un pH sous-optimaux pour la croissance peuvent être utilisés comme moyen de limiter la contamination microbienne.

Figure 4. Le processus de réaction des cellules vivantes. Ce procédé est caractérisé par l'utilisation d'une souche de production bactérienne qui ne subit pas d'autolyse dans des conditions de non-croissance. Cette propriété rend l'immobilisation inutile et permet l'utilisation d'équipements de fermentation standard. De plus, le taux d'utilisation du carbone pour la production de produits est maximisé à mesure que la croissance végétative et les fonctions d'entretien ménager sont minimisées. La séparation du produit du mélange réactionnel et le recyclage des cellules sont effectués à l'aide d'un appareil d'ultrafiltration. La purification des produits sécrétés tels que les acides aminés est facilitée par la contamination négligeable des matériaux intracellulaires. De plus, des températures et un pH sous-optimaux pour la croissance peuvent être utilisés comme moyen de limiter la contamination microbienne.

chlorhydrate de thiamine, 0,002 % FeS04.7H20, 0,002 % MnS04./tH20, 2 % éthanol. L'étape de pré-réaction consiste en un traitement thermique à 45°C pendant 5 h dans un mélange composé de 3 % poids/volume de cellules, 750 mM d'acide L-aspartique, 2 M de chlorure d'ammonium, 7,5 mM de chlorure de calcium et 0,08 % en poids. / volume Tween 20. Cette étape est conçue pour diminuer à un niveau négligeable l'activité fumarase sans affecter de manière significative l'activité aspartase. La deuxième phase est initiée en recueillant par centrifugation des cellules traitées thermiquement et en inoculant avec ces cellules un mélange réactionnel à pH 9,3 constitué de 860 mM d'acide fumarique, 4 M de NH4OH, 7,5 mM de CaCl2. Les risques de contamination sont minimisés en effectuant des opérations à une température relativement élevée (45°C) et à un pH alcalin. La troisième phase est caractérisée par un recyclage cellulaire où, profitant des caractéristiques physiologiques de C. glutamicum MJ233 (pas d'autolyse et pas de fuite de macromolécules intracellulaires), le mélange réactionnel est séparé des cellules par ultrafiltration, typiquement à l'aide d'un polysulfone à fibres creuses. membrane de type tubulaire pouvant supporter des températures élevées et un pH alcalin. En conséquence, la concentration du produit peut atteindre des niveaux allant jusqu'à environ 1,3 M. La capacité d'atteindre des concentrations de produit aussi élevées est une caractéristique industrielle importante de ce procédé car elle facilite la dernière phase, la purification du produit.

Ce procédé combine ainsi une conception rationnelle et empirique, et offre plusieurs avantages dont une mise en œuvre aisée dans des équipements de fermentation standard, l'utilisation de cellules vivantes ne nécessitant pas d'immobilisation, en plus d'une diminution des risques de contamination et d'un traitement en aval efficace. Nous avons inventé le mot LCR (Living-Cell-Reaction) pour englober toutes les modifications apportées à ce processus de base, et en particulier les schémas industriels où la phase de réaction est réalisée dans un milieu minimum dépourvu de biotine, un facteur de croissance essentiel, tel que la croissance cellulaire est stoppée. . Cette conception industrielle peut être adaptée à la production de nombreux autres produits chimiques fins tels que les acides aminés ou les acides organiques (64,65).

Nonobstant ces développements, l'utilisation industrielle des bactéries corynéformes bénéficierait de la disponibilité d'une série de vecteurs basés sur un plasmide à large spectre d'hôtes se répliquant via un mécanisme 0, comme, contrairement aux plasmides à cercle roulant typiques (50, 59) , les propriétés intrinsèques de ces épisomes incluent une stabilité structurelle et ségrégationnelle élevée (60).

Ce travail a été soutenu par une subvention du ministère de l'Économie, du Commerce et de l'Industrie (METI).

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Vecteurs de génie génétique

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Séquence d'ADN. maille de structure de molécules d'adn filaire.

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Page de destination du génie génétique, hologramme d'adn

Caractères des scientifiques tenant des icônes de chimie

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Nanotechnologies à plat avec des scientifiques menant des expériences sur le cerveau humain dans un laboratoire scientifique moderne

Cahier de microscopie illustré par le concept de conception isométrique de la nanotechnologie avec des informations scientifiques à l'écran et une grande image du modèle d'adn

Icônes de couleur de biotechnologie et de génétique

Séquence d'ADN en main. maille de structure de molécules de code d'ADN filaire.

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Des scientifiques en robes blanches étudient l'ADN à l'écran

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Illustration de la science et du laboratoire

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Technologie future avec bannière de génie génétique

Composition d'illustration isométrique de la science biologique avec microscope électronique permettant des recherches en génie génétique manipulant l'ADN des plantes

Modèle de bannière verticale de clonage humain sur le génie génétique

Médecin donnant le vaccin au patient, illustration de style dessin animé

Dentiste recherchant, illustration de style dessin animé

Docteur recherchant, illustration de style de dessin animé

Docteur recherchant, illustration de style de dessin animé

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Vecteurs en génie génétique - Présentation PowerPoint PPT

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Plasmides

Les plasmides sont des séquences d'ADN double brin, généralement circulaires, capables de se répliquer automatiquement dans une cellule hôte. Les vecteurs plasmidiques se composent au minimum de l'insert transgénique et d'une origine de réplication, ce qui permet une réplication semi-indépendante du plasmide dans l'hôte. Les plasmides modernes ont généralement beaucoup plus de caractéristiques, notamment un "site de clonage multiple" avec des surplombs de nucléotides pour l'insertion d'un insert et de multiples sites consensus d'enzymes de restriction de chaque côté de l'insert. Les plasmides peuvent être conjugatifs/transmissibles ou non conjugatifs. Les plasmides conjugatifs médient le transfert d'ADN par conjugaison et se propagent donc rapidement parmi les cellules bactériennes d'une population. Les plasmides non conjugatifs n'interviennent pas dans l'ADN par conjugaison.

Chiffre: Vecteur de clonage bactérien: Le plasmide pGEX-3x est un vecteur de clonage populaire. Les différents éléments du plasmide sont marqués.


Techniques de génie génétique [retour au sommet]

Le génie génétique est une discipline très jeune, et n'est possible que grâce au développement des techniques à partir des années 1960. Watson et Crick ont ​​rendu ces techniques possibles grâce à notre meilleure compréhension de l'ADN et de son fonctionnement suite à la découverte de sa structure en 1953. Bien que le but final du génie génétique soit généralement l'expression d'un gène dans un hôte, en fait la plupart des les techniques et le temps du génie génétique sont consacrés à l'isolement d'un gène puis à son clonage. Ce tableau liste les techniques que nous allons détailler.

Technique

But

Pour faire une copie d'ADN d'ARNm

Pour couper l'ADN à des points spécifiques, en faisant de petits fragments

Pour joindre des fragments d'ADN ensemble

Pour transporter l'ADN dans les cellules et assurer la réplication

Livrer un gène à une cellule vivante

Pour identifier les cellules qui ont été transformées

Pour faire des copies exactes de colonies bactériennes sur une plaque de gélose

Pour amplifier de très petits échantillons d'ADN

Pour identifier et marquer un morceau d'ADN contenant une certaine séquence

Pour trouver un gène particulier dans un génome entier

Arrêter l'expression d'un gène dans une cellule

Pour faire un gène à partir de zéro

Séparer des fragments d'ADN

* Informations supplémentaires qui ne sont pas directement incluses dans AS Biology. Cependant, cela peut aider à consolider d'autres techniques.

1. ADN complémentaire [retour au sommet]

L'ADN complémentaire (ADNc) est un ADN fabriqué à partir d'ARNm. Cela utilise l'enzyme transcriptase inverse, qui fait l'inverse de la transcription : il synthétise l'ADN à partir d'une matrice d'ARN. Il est produit naturellement par un groupe de virus appelé le rétrovirus (qui incluent le VIH), et cela les aide à envahir les cellules. En génie génétique, la transcriptase inverse est utilisée pour gène artificiel d'ADNc comme le montre ce diagramme.

L'ADN complémentaire a permis de résoudre différents problèmes du génie génétique :

Cela rend les gènes beaucoup plus faciles à trouver. Il y a quelque 70 000 gènes dans le génome humain, et trouver un gène parmi tant d'autres est une tâche très difficile (mais pas impossible). Cependant, une cellule donnée n'exprime que quelques gènes et ne fabrique donc que quelques types différents de molécules d'ARNm. Par exemple, les cellules b du pancréas fabriquent de l'insuline, donc fabriquent de nombreuses molécules d'ARNm codant pour l'insuline. Cet ARNm peut être isolé de ces cellules et utilisé pour fabriquer l'ADNc du gène de l'insuline.

2. Enzymes de restriction [retour au sommet]

Ce sont des enzymes qui coupent l'ADN à des sites spécifiques. Ils s'appellent proprement endonucléases de restriction car ils coupent les liaisons au milieu de la chaîne polynucléotidique. Certaines enzymes de restriction coupent directement les deux chaînes, formant extrémités émoussées, mais la plupart des enzymes coupent en quinconce les deux brins, formant extrémités collantes.

Les extrémités coupées sont « collantes » car elles ont de courtes étendues d'ADN simple brin avec des séquences complémentaires. Ces extrémités collantes colleront (ou recuire) à un autre morceau d'ADN par appariement de bases complémentaires, mais seulement s'ils ont tous deux été coupés avec le même Enzyme de restriction. Les enzymes de restriction sont hautement spécifiques et ne coupent l'ADN qu'à des séquences de bases spécifiques, longues de 4 à 8 paires de bases, appelées séquences de reconnaissance.

Les enzymes de restriction sont produites naturellement par les bactéries pour se défendre contre les virus (elles "restreignent" la croissance virale), mais elles sont extrêmement utiles en génie génétique pour couper l'ADN à des endroits précis ("ciseaux moléculaires"). De courtes longueurs d'ADN découpées par des enzymes de restriction sont appelées fragments de restriction. Il existe des milliers d'enzymes de restriction différentes connues, avec plus d'une centaine de séquences de reconnaissance différentes. Les enzymes de restriction sont nommées d'après les espèces bactériennes dont elles sont issues, donc ÉcoR1 est de E. coli souche R, et HindIII est de Haemophilis influenzae.

3. ADN ligase [retour au sommet]

Cette enzyme répare l'ADN brisé en joignant deux nucléotides dans un brin d'ADN. Il est couramment utilisé en génie génétique pour faire l'inverse d'une enzyme de restriction, c'est-à-dire pour réunir des fragments de restriction complémentaires.

Les extrémités cohésives permettent à deux fragments de restriction complémentaires de recuire, mais seulement par des liaisons hydrogène faibles, qui peuvent être assez facilement rompues, par exemple par chauffage doux. La colonne vertébrale est encore incomplète.

L'ADN ligase complète le squelette de l'ADN en formant des liaisons covalentes. Les enzymes de restriction et l'ADN ligase peuvent donc être utilisées ensemble pour joindre des longueurs d'ADN provenant de différentes sources.

4. Vecteurs [retour au sommet]

En biologie, un vecteur est quelque chose qui transporte des choses entre les espèces. Par exemple, le moustique est un vecteur de maladie car il transmet le parasite du paludisme à l'homme. En génie génétique, un vecteur est une longueur d'ADN qui porte le gène que nous voulons dans une cellule hôte. Un vecteur est nécessaire car une longueur d'ADN contenant un gène à elle seule ne fera rien à l'intérieur d'une cellule hôte. Puisqu'il ne fait pas partie du génome normal de la cellule, il ne sera pas répliqué lorsque la cellule se divise, il ne sera pas exprimé, et en fait il sera probablement décomposé assez rapidement. Un vecteur contourne ces problèmes en ayant ces propriétés :

De nombreux vecteurs différents ont été fabriqués à des fins différentes en génie génétique en modifiant des molécules d'ADN naturelles, et ceux-ci sont maintenant disponibles dans le commerce. Par exemple un vecteur de clonage contient des séquences qui font que le gène est copié (peut-être plusieurs fois) à l'intérieur d'une cellule, mais pas exprimé. Un vecteur d'expression contient des séquences provoquant l'expression du gène à l'intérieur d'une cellule, de préférence en réponse à un stimulus externe, tel qu'un produit chimique particulier dans le milieu. Différents types de vecteurs sont également disponibles pour différentes longueurs d'insert d'ADN :

Plasmide

Chromosome artificiel bactérien (BAC)

5. Plasmides [retour au sommet]

Les plasmides sont de loin le type de vecteur le plus courant, nous allons donc voir comment ils sont utilisés en détail. Les plasmides sont de courts morceaux circulaires d'ADN que l'on trouve naturellement dans les cellules bactériennes. Un plasmide typique contient 3 à 5 gènes et il y a généralement environ 10 copies d'un plasmide dans une cellule bactérienne. Les plasmides sont copiés séparément de l'ADN bactérien principal lorsque la cellule se divise, de sorte que les gènes plasmidiques sont transmis à toutes les cellules filles. Ils sont également utilisés naturellement pour l'échange de gènes entre les cellules bactériennes (au plus près du sexe), de sorte que les cellules bactériennes absorberont facilement un plasmide. Parce qu'ils sont si petits, ils sont faciles à manipuler dans un tube à essai, et des gènes étrangers peuvent assez facilement y être incorporés à l'aide d'enzymes de restriction et d'ADN ligase.

L'un des plasmides les plus couramment utilisés est le R-plasmide (ou pBR322). Ce plasmide contient une origine de réplication, plusieurs séquences de reconnaissance pour différentes enzymes de restriction (avec des noms comme TVPmoi et ÉcoRI), et deux gènes marqueurs, qui confèrent une résistance à différents antibiotiques (ampicilline et tétracycline).

Le diagramme ci-dessous montre comment des fragments d'ADN peuvent être incorporés dans un plasmide à l'aide d'enzymes de restriction et de ligase. L'enzyme de restriction utilisée ici (TVPI) coupe le plasmide au milieu de l'un des gènes marqueurs (nous verrons pourquoi cela est utile plus tard). L'ADN étranger s'hybride avec le plasmide et est joint de manière covalente par l'ADN ligase pour former un vecteur hybride (en d'autres termes un mélange ou un hybride d'ADN bactérien et étranger). Plusieurs autres produits sont également formés : certains plasmides se re-hybrideront simplement avec eux-mêmes pour reformer le plasmide d'origine, et certains fragments d'ADN se joindront pour former des chaînes ou des cercles. Ces différents produits ne peuvent pas être facilement séparés, mais cela n'a pas d'importance, car les gènes marqueurs peuvent être utilisés plus tard pour identifier le bon vecteur hybride.

6. Transfert de gènes [retour au sommet]

Les vecteurs contenant les gènes que nous voulons doivent être incorporés dans des cellules vivantes afin qu'ils puissent être répliqués ou exprimés. Les cellules recevant le vecteur sont appelées des cellules hôtes, et une fois qu'ils ont incorporé avec succès le vecteur, ils sont dits transformé. Les vecteurs sont de grosses molécules qui ne traversent pas facilement les membranes cellulaires, de sorte que les membranes doivent être rendues perméables d'une manière ou d'une autre. Il existe différentes manières de procéder selon le type de cellule hôte.

1. Les bactériophages (ou phages) sont des virus qui infectent les bactéries. Ils constituent un moyen très efficace de transmettre de gros gènes dans des cellules bactériennes en culture.

2. Adénovirus sont des virus humains qui causent des maladies respiratoires dont le rhume. Leur matériel génétique est de l'ADN double brin et ils sont idéaux pour transmettre des gènes à des patients vivants en thérapie génique. Leur ADN n'est pas incorporé dans les chromosomes de l'hôte, il n'est donc pas répliqué, mais leurs gènes sont exprimés.

L'adénovirus est génétiquement modifié de sorte que ses protéines d'enveloppe ne sont pas synthétisées, de sorte que de nouvelles particules virales ne peuvent pas être assemblées et la cellule hôte n'est pas tuée.

3. Rétrovirus sont un groupe de virus humains qui incluent le VIH. Ils sont enfermés dans une membrane lipidique et leur matériel génétique est un ARN double brin. Lors de l'infection, cet ARN est copié dans l'ADN et l'ADN est incorporé dans le chromosome de l'hôte. Cela signifie que les gènes étrangers sont répliqués dans chaque cellule fille.

Après un certain temps, l'ADN dormant est activé et les gènes sont exprimés dans toutes les cellules hôtes.

7. Marqueurs génétiques [retour au sommet]

Ceux-ci sont nécessaires pour identifier les cellules qui ont absorbé avec succès un vecteur et ainsi se sont transformées. Avec la plupart des techniques ci-dessus, moins de 1% des cellules absorbent réellement le vecteur, un marqueur est donc nécessaire pour distinguer ces cellules de toutes les autres. Nous verrons comment procéder avec des cellules hôtes bactériennes, car c'est la technique la plus courante.

Un marqueur commun, utilisé dans le plasmide R, est un gène de résistance à un antibiotique tel que la tétracycline. Les cellules bactériennes absorbant ce plasmide peuvent fabriquer ce produit génique et sont donc résistantes à cet antibiotique. Donc, si les cellules sont cultivées sur un milieu contenant de la tétracycline, toutes les cellules normales non transformées, ainsi que les cellules qui ont absorbé de l'ADN qui ne se trouve pas dans un plasmide (99 %) mourront. Seules les cellules transformées à 1 % survivront et celles-ci pourront ensuite être cultivées et clonées sur une autre plaque.

8. Placage de réplique [retour au sommet]

Le placage de réplique est une technique simple pour faire une copie exacte d'une plaque de gélose. Un tampon de tissu stérile de la même taille que la plaque est pressé sur la surface d'une plaque de gélose avec des bactéries qui se développent dessus. Certaines cellules de chaque colonie colleront au tissu. Si le tissu est ensuite pressé sur une nouvelle plaque de gélose, certaines cellules seront déposées et les colonies se développeront exactement dans les mêmes positions sur la nouvelle plaque. Cette technique a un certain nombre d'utilisations, mais l'utilisation la plus courante en génie génétique est d'aider à résoudre un autre problème dans l'identification des cellules transformées.

Ce problème est de distinguer les cellules qui ont occupé une hybride vecteur plasmidique (avec un gène étranger dedans) de ces cellules qui ont pris le Ordinaire plasmide. C'est là que le deuxième gène marqueur (de résistance à l'ampicilline) est utilisé. Si le gène étranger est inséré au milieu de ce gène marqueur, le gène marqueur est perturbé et ne produira pas son propre produit génique. Ainsi, les cellules avec le plasmide hybride seront tuées par l'ampicilline, tandis que les cellules avec le plasmide normal seront immunisées contre l'ampicilline. Étant donné que cette méthode d'identification implique de tuer les cellules que nous voulons, nous devons d'abord fabriquer une plaque de gélose maîtresse, puis en faire une réplique pour tester la résistance à l'ampicilline.

Une fois que les colonies de cellules contenant le vecteur plasmidique hybride correct ont été identifiées, les colonies appropriées sur la plaque maîtresse peuvent être sélectionnées et cultivées sur une autre plaque.

Le plasmide R avec ses gènes de résistance aux antibiotiques date des premiers jours du génie génétique dans les années 1970. Ces dernières années, de meilleurs plasmides avec différents gènes marqueurs ont été développés qui ne tuent pas les cellules souhaitées et n'ont donc pas besoin d'une réplique de plaque. Ces nouveaux gènes marqueurs fabriquent une enzyme (en fait la lactase) qui convertit un substrat incolore dans le milieu gélosé en un produit de couleur bleue facilement visible. Ainsi, les cellules avec un plasmide normal deviennent bleues sur le bon milieu, tandis que celles avec le plasmide hybride ne peuvent pas fabriquer l'enzyme et rester blanches. Ces colonies blanches peuvent être facilement identifiées et transférées sur une autre plaque. Un autre gène marqueur, transféré de la méduse, produit une protéine fluorescente verte (GFP).

9. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) [retour au sommet]

Les gènes peuvent être clonés en clonant les cellules bactériennes qui les contiennent, mais cela nécessite en premier lieu beaucoup d'ADN. La PCR peut cloner (ou amplifier) Des échantillons d'ADN aussi petits qu'une seule molécule. Il s'agit d'une technique plus récente, développée en 1983 par Kary Mullis, pour laquelle il a remporté le prix Nobel en 1993. La réaction en chaîne par polymérase est simplement la réplication de l'ADN dans un tube à essai. Si une longueur d'ADN est mélangée avec les quatre nucléotides (A, T, C et G) et l'enzyme ADN polymérase dans un tube à essai, alors l'ADN sera répliqué plusieurs fois. Les détails sont indiqués dans ce schéma :

La PCR peut être complètement automatisée, de sorte qu'en quelques heures un petit échantillon d'ADN peut être amplifié des millions de fois avec peu d'effort. Le produit peut être utilisé pour d'autres études, telles que le clonage, l'électrophorèse ou les sondes génétiques. Parce que la PCR peut utiliser de si petits échantillons, elle peut être utilisée en médecine légale (avec de l'ADN prélevé à partir d'échantillons de sang, de cheveux ou de sperme), et peut même être utilisée pour copier l'ADN de corps humains momifiés, de mammouths laineux éteints ou d'un insecte qui est été enrobé d'ambre depuis le Jurassique. L'un des problèmes de la PCR est d'avoir un échantillon d'ADN suffisamment pur pour commencer. Tout ADN contaminant sera également amplifié, ce qui peut poser des problèmes, par exemple dans les affaires judiciaires.

10. Sondes ADN [retour au sommet]

Ceux-ci sont utilisés pour identifier et marquer des fragments d'ADN qui contiennent une séquence spécifique. Une sonde est simplement une courte longueur d'ADN (20-100 nucléotides de long) avec un marqueur attaché. Deux types d'étiquettes sont couramment utilisés :

Les sondes sont toujours monocaténaires et peuvent être constituées d'ADN ou d'ARN. Si une sonde est ajoutée à un mélange de différents morceaux d'ADN (par exemple des fragments de restriction), elle s'hybridera (paire de bases) avec n'importe quelle longueur d'ADN contenant la séquence complémentaire. Ces fragments seront désormais marqués et se démarqueront du reste de l'ADN. Les sondes ADN ont de nombreuses utilisations en génie génétique :

11. Fusil à pompe [retour au sommet]

Ceci est utilisé pour trouver un gène particulier dans un génome entier, un peu comme trouver l'aiguille proverbiale dans une botte de foin. C'est ce qu'on appelle la technique du fusil de chasse parce qu'elle commence par briser le génome sans discernement (comme tirer un fusil de chasse sur une cible molle), puis trier les débris pour le gène particulier que nous voulons. Pour que cela fonctionne, une sonde génétique pour le gène est nécessaire, ce qui signifie qu'au moins une courte partie de la séquence du gène doit être connue.

12. Gènes antisens [retour au sommet]

Ceux-ci sont utilisés pour désactiver l'expression d'un gène dans une cellule. Le principe est très simple : une copie du gène à désactiver est insérée dans le génome de l'hôte à l'envers, pour que le brin complémentaire (ou antisens) soit transcrit. L'ARNm antisens produit s'hybridera à l'ARNm sens normal formant un ARN double brin. Les ribosomes ne peuvent pas s'y lier, donc l'ARNm n'est pas traduit et le gène est effectivement « désactivé ».

13. Synthèse des gènes [retour au sommet]

Il est possible de synthétiser chimiquement un gène en laboratoire en joignant laborieusement des nucléotides ensemble dans le bon ordre. Les machines automatisées peuvent maintenant rendre cela beaucoup plus facile, mais seulement jusqu'à une limite d'environ 30 pb, donc très peu de gènes réels pourraient être fabriqués de cette manière (de toute façon, il est généralement beaucoup plus facile de produire de l'ADNc). Les gènes des deux chaînes d'insuline (xx pb) et de l'hormone somatostatine (42 pb) ont ainsi été synthétisés. Il est très utile pour fabriquer des sondes génétiques.

14. Électrophorèse [retour au sommet]

Il s'agit d'une forme de chromatographie utilisée pour séparer différents morceaux d'ADN en fonction de leur longueur. Il peut généralement être utilisé pour séparer des fragments de restriction. Les échantillons d'ADN sont placés dans des puits à une extrémité d'une mince plaque de gel faite de agarose ou polyacrylamide, et recouvert d'une solution tampon. Un courant électrique traverse le gel. Chaque nucléotide d'une molécule d'ADN contient un groupe phosphate chargé négativement, de sorte que l'ADN est attiré par l'anode (l'électrode positive). Les molécules doivent diffuser à travers le gel, et les petites longueurs d'ADN se déplacent plus rapidement que les plus grandes longueurs, qui sont retardées par le gel. Ainsi, plus la longueur de la molécule d'ADN est petite, plus elle descendra dans le gel dans un temps donné. A la fin de la course, le courant est coupé.

Malheureusement, l'ADN sur le gel ne peut pas être vu, il doit donc être visualisé. Il existe trois méthodes courantes pour ce faire :


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Contenu

Le terme plasmide a été introduit en 1952 par le biologiste moléculaire américain Joshua Lederberg pour désigner « tout déterminant héréditaire extrachromosomique ». [4] L'utilisation précoce du terme incluait tout matériel génétique bactérien qui existe de manière extrachromosomique pendant au moins une partie de son cycle de réplication, mais comme cette description inclut les virus bactériens, la notion de plasmide a été affinée au fil du temps pour comprendre des éléments génétiques qui se reproduisent de manière autonome. [5] Plus tard en 1968, il a été décidé que le terme plasmide devrait être adopté comme terme pour l'élément génétique extrachromosomique, [6] et pour le distinguer des virus, la définition a été réduite aux éléments génétiques qui existent exclusivement ou principalement en dehors du chromosome et peut se répliquer de façon autonome. [5]

Pour que les plasmides se répliquent indépendamment dans une cellule, ils doivent posséder un tronçon d'ADN qui peut agir comme une origine de réplication. L'unité d'auto-réplication, dans ce cas, le plasmide, est appelée un réplicon. Un réplicon bactérien typique peut consister en un certain nombre d'éléments, tels que le gène de la protéine d'initiation de la réplication spécifique au plasmide (Rep), des unités répétitives appelées itérones, des boîtes DnaA et une région adjacente riche en AT. [5] Les plasmides plus petits utilisent les enzymes réplicatives de l'hôte pour faire des copies d'eux-mêmes, tandis que les plasmides plus grands peuvent porter des gènes spécifiques pour la réplication de ces plasmides. Quelques types de plasmides peuvent également s'insérer dans le chromosome hôte, et ces plasmides intégratifs sont parfois appelés épisomes chez les procaryotes. [7]

Les plasmides portent presque toujours au moins un gène. De nombreux gènes portés par un plasmide sont bénéfiques pour les cellules hôtes, par exemple : permettre à la cellule hôte de survivre dans un environnement qui serait autrement mortel ou restrictif pour la croissance. Certains de ces gènes codent pour des traits de résistance aux antibiotiques ou de résistance aux métaux lourds, tandis que d'autres peuvent produire des facteurs de virulence qui permettent à une bactérie de coloniser un hôte et de surmonter ses défenses ou ont des fonctions métaboliques spécifiques qui permettent à la bactérie d'utiliser un nutriment particulier, y compris le capacité à dégrader les composés organiques récalcitrants ou toxiques. [5] Les plasmides peuvent également fournir aux bactéries la capacité de fixer l'azote. Certains plasmides, cependant, n'ont aucun effet observable sur le phénotype de la cellule hôte ou son bénéfice pour les cellules hôtes ne peut pas être déterminé, et ces plasmides sont appelés plasmides cryptiques. [8]

Les plasmides naturels varient considérablement dans leurs propriétés physiques. Leur taille peut aller de très petits mini-plasmides de moins de 1 kilo paires de bases (Kbp) à de très grands mégaplasmides de plusieurs paires de mégabases (Mbp). À l'extrémité supérieure, peu de différences entre un mégaplasmide et un minichromosome. Les plasmides sont généralement circulaires, mais des exemples de plasmides linéaires sont également connus. Ces plasmides linéaires nécessitent des mécanismes spécialisés pour répliquer leurs extrémités. [5]

Les plasmides peuvent être présents dans une cellule individuelle en nombre variable, allant d'une à plusieurs centaines. Le nombre normal de copies de plasmide que l'on peut trouver dans une seule cellule est appelé nombre de copies de plasmide et est déterminé par la façon dont l'initiation de la réplication est régulée et la taille de la molécule. Les plasmides plus gros ont tendance à avoir un nombre de copies inférieur. [7] Les plasmides à faible nombre de copies qui n'existent qu'en une ou quelques copies dans chaque bactérie risquent, lors de la division cellulaire, d'être perdus dans l'une des bactéries ségrégeantes. De tels plasmides à copie unique ont des systèmes qui tentent de distribuer activement une copie aux deux cellules filles. Ces systèmes, qui comprennent le système parABS et le système parMRC, sont souvent appelés système de partition ou fonction de partition d'un plasmide.

Les plasmides peuvent être classés de plusieurs manières. Les plasmides peuvent être largement classés en plasmides conjugatifs et en plasmides non conjugatifs. Les plasmides conjugatifs contiennent un ensemble de gènes de transfert qui favorisent la conjugaison sexuelle entre différentes cellules. [7] Dans le processus complexe de conjugaison, les plasmides peuvent être transférés d'une bactérie à une autre via des pili sexuels codés par certains des gènes de transfert (voir figure). [9] Les plasmides non conjugatifs sont incapables d'initier la conjugaison, ils ne peuvent donc être transférés qu'avec l'aide de plasmides conjugatifs. Une classe intermédiaire de plasmides est mobilisable et ne porte qu'un sous-ensemble des gènes nécessaires au transfert. Ils peuvent parasiter un plasmide conjugatif, ne transférant à haute fréquence qu'en sa présence.

Les plasmides peuvent également être classés en groupes d'incompatibilité. Un microbe peut héberger différents types de plasmides, mais différents plasmides ne peuvent exister dans une seule cellule bactérienne que s'ils sont compatibles. Si deux plasmides ne sont pas compatibles, l'un ou l'autre sera rapidement perdu de la cellule. Différents plasmides peuvent donc être affectés à différents groupes d'incompatibilité selon qu'ils peuvent coexister ensemble. Les plasmides incompatibles (appartenant au même groupe d'incompatibilité) partagent normalement les mêmes mécanismes de réplication ou de partition et ne peuvent donc pas être conservés ensemble dans une seule cellule. [10] [11]

Une autre façon de classer les plasmides est par fonction. Il existe cinq classes principales :

  • Les plasmides F de fertilité, qui contiennent tra gènes. Ils sont capables de conjugaison et aboutissent à l'expression de pili sexuels.
  • Plasmides de résistance (R), qui contiennent des gènes qui confèrent une résistance aux antibiotiques ou aux poisons. Historiquement connus sous le nom de facteurs R, avant que la nature des plasmides ne soit comprise.
  • Plasmides Col, qui contiennent des gènes qui codent pour les bactériocines, des protéines qui peuvent tuer d'autres bactéries.
  • Plasmides dégradants, qui permettent la digestion de substances inhabituelles, par ex. toluène et acide salicylique.
  • Plasmides de virulence, qui transforment la bactérie en agent pathogène. par exemple. Plasmide Ti dans Agrobacterium tumefaciens

Les plasmides peuvent appartenir à plusieurs de ces groupes fonctionnels.

Des plasmides construits artificiellement peuvent être utilisés comme vecteurs en génie génétique. Ces plasmides sont des outils importants dans les laboratoires de génétique et de biotechnologie, où ils sont couramment utilisés pour cloner et amplifier (faire de nombreuses copies) ou exprimer des gènes particuliers. [12] Une grande variété de plasmides sont disponibles dans le commerce pour de telles utilisations. Le gène à répliquer est normalement inséré dans un plasmide qui contient typiquement un certain nombre de caractéristiques pour leur utilisation. Ceux-ci comprennent un gène qui confère une résistance à des antibiotiques particuliers (l'ampicilline est le plus souvent utilisée pour les souches bactériennes), une origine de réplication pour permettre aux cellules bactériennes de répliquer l'ADN plasmidique et un site approprié pour le clonage (appelé site de clonage multiple ).

L'instabilité structurelle de l'ADN peut être définie comme une série d'événements spontanés qui aboutissent à un réarrangement, une perte ou un gain imprévus de matériel génétique. De tels événements sont fréquemment déclenchés par la transposition d'éléments mobiles ou par la présence d'éléments instables tels que des structures non canoniques (non B). Les régions accessoires appartenant au squelette bactérien peuvent s'engager dans un large éventail de phénomènes d'instabilité structurelle.Les catalyseurs bien connus d'instabilité génétique comprennent les répétitions directes, inversées et en tandem, qui sont connues pour être visibles dans un grand nombre de vecteurs de clonage et d'expression disponibles dans le commerce. [13] Les séquences d'insertion peuvent également avoir un impact important sur la fonction et le rendement des plasmides, en entraînant des suppressions et des réarrangements, une activation, une régulation négative ou une inactivation de l'expression des gènes voisins. [14] Par conséquent, la réduction ou l'élimination complète des séquences de squelette non codantes étrangères réduirait de manière significative la propension à de tels événements et, par conséquent, le potentiel recombinogène global du plasmide. [15] [16]

Clonage Modifier

Les plasmides sont les vecteurs de clonage bactérien les plus couramment utilisés. [17] Ces vecteurs de clonage contiennent un site qui permet à des fragments d'ADN d'être insérés, par exemple un site de clonage multiple ou un polylinker qui a plusieurs sites de restriction couramment utilisés auxquels des fragments d'ADN peuvent être liés. Une fois le gène d'intérêt inséré, les plasmides sont introduits dans les bactéries par un processus appelé transformation. Ces plasmides contiennent un marqueur sélectionnable, généralement un gène de résistance aux antibiotiques, qui confère aux bactéries une capacité à survivre et à proliférer dans un milieu de croissance sélectif contenant les antibiotiques particuliers. Les cellules après transformation sont exposées aux milieux sélectifs, et seules les cellules contenant le plasmide peuvent survivre. De cette façon, les antibiotiques agissent comme un filtre pour sélectionner uniquement les bactéries contenant l'ADN plasmidique. Le vecteur peut également contenir d'autres gènes marqueurs ou gènes rapporteurs pour faciliter la sélection de plasmides avec des inserts clonés. Les bactéries contenant le plasmide peuvent ensuite être cultivées en grandes quantités, récoltées, et le plasmide d'intérêt peut ensuite être isolé en utilisant diverses méthodes de préparation de plasmide.

Un vecteur de clonage plasmidique est généralement utilisé pour cloner des fragments d'ADN jusqu'à 15 kpb. [18] Pour cloner de plus longues longueurs d'ADN, on utilise des phages lambda avec des gènes de lysogénie supprimés, des cosmides, des chromosomes artificiels bactériens ou des chromosomes artificiels de levure.

Production de protéines Modifier

Une autre utilisation majeure des plasmides est de fabriquer de grandes quantités de protéines. Dans ce cas, les chercheurs cultivent des bactéries contenant un plasmide hébergeant le gène d'intérêt. Tout comme la bactérie produit des protéines pour conférer sa résistance aux antibiotiques, elle peut également être induite à produire de grandes quantités de protéines à partir du gène inséré. Il s'agit d'un moyen peu coûteux et facile de produire en masse la protéine que code le gène, par exemple l'insuline.

Thérapie génique Modifier

Les plasmides peuvent également être utilisés pour le transfert de gènes en tant que traitement potentiel en thérapie génique afin qu'ils puissent exprimer la protéine qui manque dans les cellules. Certaines formes de thérapie génique nécessitent l'insertion de gènes thérapeutiques dans des sites cibles chromosomiques présélectionnés dans le génome humain. Les vecteurs plasmidiques sont l'une des nombreuses approches qui pourraient être utilisées à cette fin. Les nucléases à doigt de zinc (ZFN) offrent un moyen de provoquer une rupture double brin spécifique au site du génome de l'ADN et de provoquer une recombinaison homologue. Les plasmides codant pour la ZFN pourraient aider à délivrer un gène thérapeutique à un site spécifique afin d'éviter les dommages cellulaires, les mutations cancérigènes ou une réponse immunitaire. [19]

Modèles de maladies Modifier

Les plasmides ont été historiquement utilisés pour modifier génétiquement les cellules souches embryonnaires de rats afin de créer des modèles de maladies génétiques chez le rat. L'efficacité limitée des techniques basées sur les plasmides a empêché leur utilisation dans la création de modèles de cellules humaines plus précis. Cependant, les développements des techniques de recombinaison de virus adéno-associés et des nucléases à doigt de zinc ont permis la création d'une nouvelle génération de modèles isogéniques de maladies humaines.

Le terme épisome a été introduit par François Jacob et Élie Wollman en 1958 pour désigner le matériel génétique extra-chromosomique qui peut se répliquer de manière autonome ou s'intégrer dans le chromosome. [20] [21] Depuis que le terme a été introduit, cependant, son utilisation a changé, comme plasmide est devenu le terme préféré pour la réplication autonome de l'ADN extrachromosomique. Lors d'un symposium à Londres en 1968, certains participants ont suggéré que le terme épisome être abandonné, bien que d'autres aient continué à utiliser le terme avec un changement de sens. [22] [23]

Aujourd'hui, certains auteurs utilisent épisome dans le contexte des procaryotes pour désigner un plasmide capable de s'intégrer dans le chromosome. Les plasmides intégratifs peuvent être répliqués et maintenus de manière stable dans une cellule sur plusieurs générations, mais à un certain stade, ils existeront en tant que molécule plasmidique indépendante. [24] Dans le contexte des eucaryotes, le terme épisome est utilisé pour désigner une molécule d'ADN circulaire fermée extrachromosomique non intégrée qui peut être répliquée dans le noyau. [25] [26] Les virus en sont les exemples les plus courants, tels que les virus de l'herpès, les adénovirus et les polyomavirus, mais certains sont des plasmides. D'autres exemples incluent des fragments chromosomiques aberrants, tels que des chromosomes à double minute, qui peuvent survenir lors d'amplifications artificielles de gènes ou dans des processus pathologiques (par exemple, la transformation de cellules cancéreuses). Les épisomes chez les eucaryotes se comportent de manière similaire aux plasmides chez les procaryotes en ce que l'ADN est maintenu de manière stable et répliqué avec la cellule hôte. Des épisomes viraux cytoplasmiques (comme dans les infections à poxvirus) peuvent également se produire. Certains épisomes, tels que les virus de l'herpès, se répliquent selon un mécanisme de cercle tournant, similaire aux virus bactériens phagiques. D'autres se répliquent via un mécanisme de réplication bidirectionnelle (Type thêta plasmides). Dans les deux cas, les épisomes restent physiquement séparés des chromosomes de la cellule hôte. Plusieurs virus cancéreux, y compris le virus d'Epstein-Barr et le virus de l'herpès associé au sarcome de Kaposi, sont maintenus sous forme d'épisomes latents distincts sur le plan chromosomique dans les cellules cancéreuses, où les virus expriment des oncogènes qui favorisent la prolifération des cellules cancéreuses. Dans les cancers, ces épisomes se répliquent passivement avec les chromosomes de l'hôte lorsque la cellule se divise. Lorsque ces épisomes viraux initient une réplication lytique pour générer de multiples particules virales, ils activent généralement les mécanismes de défense de l'immunité innée cellulaire qui tuent la cellule hôte.

Certains plasmides ou hôtes microbiens comprennent un système de dépendance ou un système de destruction post-ségrégational (PSK), tel que le système hok/sok (host kill/suppressor of kill) du plasmide R1 dans Escherichia coli. [27] Cette variante produit à la fois un poison de longue durée et un antidote de courte durée. Plusieurs types de systèmes d'addiction plasmidique (toxine/antitoxine, basés sur le métabolisme, systèmes ORT) ont été décrits dans la littérature [28] et utilisés dans des applications biotechniques (fermentation) ou biomédicales (vaccinothérapie). Les cellules filles qui conservent une copie du plasmide survivent, tandis qu'une cellule fille qui n'hérite pas du plasmide meurt ou subit un taux de croissance réduit en raison du poison persistant de la cellule mère. Enfin, la productivité globale pourrait être améliorée.

En revanche, les plasmides utilisés en biotechnologie, tels que pUC18, pBR322 et les vecteurs dérivés, contiennent rarement des systèmes de dépendance toxine-antitoxine et doivent donc être maintenus sous pression antibiotique pour éviter la perte de plasmide.

Les levures hébergent naturellement divers plasmides. Parmi eux figurent les plasmides de 2 m - de petits plasmides circulaires souvent utilisés pour le génie génétique de la levure - et les plasmides pGKL linéaires de Kluyveromyces lactis, qui sont responsables des phénotypes tueurs. [29]

D'autres types de plasmides sont souvent liés à des vecteurs de clonage de levure qui incluent :

  • Plasmide intégrateur de levure (YIp), vecteurs de levure qui reposent sur l'intégration dans le chromosome hôte pour la survie et la réplication, et sont généralement utilisés lors de l'étude de la fonctionnalité d'un gène solo ou lorsque le gène est toxique. Également lié au gène URA3, qui code une enzyme liée à la biosynthèse des nucléotides pyrimidiques (T, C)
  • Plasmide réplicatif de levure (YRp), qui transportent une séquence d'ADN chromosomique qui comprend une origine de réplication. Ces plasmides sont moins stables, car ils peuvent être perdus lors du bourgeonnement.

Les plasmides sont souvent utilisés pour purifier une séquence spécifique, car ils peuvent facilement être purifiés du reste du génome. Pour leur utilisation comme vecteurs et pour le clonage moléculaire, les plasmides doivent souvent être isolés.

Il existe plusieurs méthodes pour isoler l'ADN plasmidique des bactéries, allant du miniprep au maxiprep ou au bulkprep. [12] Le premier peut être utilisé pour découvrir rapidement si le plasmide est correct dans l'un des nombreux clones bactériens. Le rendement est une petite quantité d'ADN plasmidique impur, ce qui est suffisant pour l'analyse par digestion de restriction et pour certaines techniques de clonage.

Dans ce dernier, des volumes beaucoup plus importants de suspension bactérienne sont cultivés à partir desquels une maxi-prep peut être effectuée. Il s'agit essentiellement d'une mini-préparation à grande échelle suivie d'une purification supplémentaire. Il en résulte des quantités relativement importantes (plusieurs centaines de microgrammes) d'ADN plasmidique très pur.

De nombreux kits commerciaux ont été créés pour effectuer l'extraction de plasmides à différentes échelles, puretés et niveaux d'automatisation.

L'ADN plasmidique peut apparaître dans l'une des cinq conformations, qui (pour une taille donnée) fonctionnent à des vitesses différentes dans un gel pendant l'électrophorèse. Les conformations sont répertoriées ci-dessous par ordre de mobilité électrophorétique (vitesse pour une tension appliquée donnée) de la plus lente à la plus rapide :

  • Ouvert-circulaire entaillé L'ADN a un brin coupé.
  • Circulaire détendue L'ADN est entièrement intact avec les deux brins non coupés mais a été enzymatiquement détendu (superbobines supprimées). Cela peut être modélisé en laissant une rallonge torsadée se dérouler et se détendre, puis en la branchant sur elle-même.
  • Linéaire L'ADN a des extrémités libres, soit parce que les deux brins ont été coupés, soit parce que l'ADN était linéaire in vivo. Cela peut être modélisé avec une rallonge électrique qui n'est pas branchée sur elle-même.
  • Super enroulé (ou circulaire fermée de manière covalente) L'ADN est entièrement intact avec les deux brins non coupés et avec une torsion intégrale, ce qui donne une forme compacte. Cela peut être modélisé en tordant une rallonge puis en la branchant sur elle-même.
  • Super enroulé dénaturé L'ADN est comme ADN superenroulé, mais a des régions non appariées qui le rendent légèrement moins compact, cela peut résulter d'une alcalinité excessive lors de la préparation du plasmide.

Le taux de migration pour les petits fragments linéaires est directement proportionnel à la tension appliquée aux basses tensions. À des tensions plus élevées, les fragments plus gros migrent à des vitesses continuellement croissantes mais différentes. Ainsi, la résolution d'un gel diminue avec l'augmentation de la tension.

A une tension basse spécifiée, la vitesse de migration de petits fragments d'ADN linéaires est fonction de leur longueur. Les grands fragments linéaires (plus de 20 kb environ) migrent à une certaine vitesse fixe quelle que soit leur longueur. C'est parce que les molécules « se répercutent », la majeure partie de la molécule suivant l'extrémité avant à travers la matrice de gel. Les digestions par restriction sont fréquemment utilisées pour analyser des plasmides purifiés. Ces enzymes cassent spécifiquement l'ADN à certaines séquences courtes. Les fragments linéaires résultants forment des « bandes » après électrophorèse sur gel. Il est possible de purifier certains fragments en coupant les bandes du gel et en dissolvant le gel pour libérer les fragments d'ADN.

En raison de sa conformation serrée, l'ADN superenroulé migre plus rapidement à travers un gel que l'ADN linéaire ou circulaire ouvert.

L'utilisation des plasmides comme technique de biologie moléculaire est soutenue par un logiciel de bioinformatique. Ces programmes enregistrent la séquence d'ADN des vecteurs plasmidiques, aident à prédire les sites de coupure des enzymes de restriction et à planifier les manipulations. Des exemples de progiciels qui gèrent les cartes plasmidiques sont ApE, Clone Manager, GeneConstructionKit, Geneious, Genome Compiler, LabGenius, Lasergene, MacVector, pDraw32, Serial Cloner, VectorFriends, Vector NTI et WebDSV. Ces logiciels permettent de mener des expériences entières in silico avant de faire des expériences humides. [30]

De nombreux plasmides ont été créés au fil des ans et les chercheurs ont distribué des plasmides à des bases de données de plasmides telles que les organisations à but non lucratif Addgene et BCCM/LMBP. On peut trouver et demander des plasmides à partir de ces bases de données pour la recherche. Les chercheurs téléchargent également souvent des séquences de plasmides dans la base de données NCBI, à partir de laquelle des séquences de plasmides spécifiques peuvent être récupérées.


Vecteurs pour le génie génétique - Biologie

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