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B2. Détermination de séquences par spectrométrie de masse - Biologie

B2. Détermination de séquences par spectrométrie de masse - Biologie



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La spectrométrie de masse supplante les méthodes plus traditionnelles (voir ci-dessus) comme choix pour déterminer la masse moléculaire et la structure d'une protéine. Sa puissance vient de sa sensibilité exquise et de ses méthodes de calcul modernes pour déterminer la structure grâce à des comparaisons de données de fragments d'ions avec des bases de données informatiques de structures de protéines connues. En spectrométrie de masse, une molécule est d'abord ionisée dans une source d'ions. Les particules chargées sont ensuite accélérées par un champ électrique dans un analyseur de masse où elles sont soumises à un champ magnétique externe. Le champ magnétique externe interagit avec le champ magnétique résultant du mouvement des particules chargées, les faisant dévier. La déviation est proportionnelle au rapport masse/charge, m/z. Les ions pénètrent alors dans le détecteur qui est généralement un photomultiplicateur. L'introduction de l'échantillon dans la source d'ions se fait par simple diffusion de gaz et de liquides volatils à partir d'un réservoir, par injection d'un échantillon liquide contenant l'analyte par pulvérisation d'un fin brouillard, ou pour les très grosses protéines en désorbant une protéine d'une matrice à l'aide d'un laser. L'analyse des mélanges complexes se fait en couplant la HPLC avec la spectrométrie de masse dans un LCMS.

Source d'ions : Il existe de nombreuses méthodes pour ioniser les molécules, notamment l'ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI), l'ionisation chimique (CI) ou l'impact électronique (EI). Les méthodes les plus courantes pour les analyses de protéines/peptides sont l'ionisation par électrospray (ESI) et l'ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI).

Ionisation par électrospray (ESI) - L'analyte, dissous dans un solvant volatil comme le méthanol ou l'acétonitrile, est injecté à travers un capillaire fin en acier inoxydable à un débit lent dans la source d'ions. Une haute tension (3-4 kV) est maintenue sur le capillaire lui donnant une charge positive par rapport à l'autre électrode de charge opposée. Le liquide qui s'écoule se charge avec la même polarité que la polarité du capillaire chargé positivement. Le champ élevé conduit à l'émergence de l'échantillon sous la forme d'un aérosol chargé de microgouttes chargées qui réduit les répulsions électrostatiques dans le liquide. Ce procédé utilise essentiellement de l'énergie électrique pour produire l'aérosol au lieu de l'énergie mécanique pour produire un aérosol liquide, comme dans le cas d'un atomiseur de parfum. Autour du capillaire s'écoule un gaz (azote) qui aide à déplacer l'aérosol vers l'analyseur de masse. Les microgouttes deviennent plus petites à mesure que le solvant volatil s'évapore, augmentant la densité de charge positive sur les gouttes. Finalement, les répulsions électrostatiques font exploser les gouttes en une série d'étapes, produisant finalement un analyte dépourvu de solvant. Cette méthode douce d'ionisation produit des analytes qui ne sont pas clivés mais prêts à être introduits dans l'analyseur de masse. Les protéines émergent de ce processus avec une distribution grossièrement gaussienne de charges positives sur les chaînes latérales basiques. En chimie organique, vous avez étudié les spectres de masse de petites molécules induits par le bombardement électronique. Cela produit des ions de charge +1 lorsqu'un électron est retiré de la molécule neutre. Le pic m/z le plus élevé du spectre est l'ion parent ou l'ion M+. Le rapport m/z le plus élevé détectable dans le spectre de masse se compte en milliers. Cependant, de gros peptides et protéines avec de grandes masses moléculaires peuvent être détectés et résolus puisque la charge sur les ions est supérieure à +1. En 2002, John Fenn a reçu un prix noble de chimie pour le développement et l'utilisation de l'ESI pour étudier des molécules biologiques.

Un exemple d'un spectre ESI de l'apo-myoglobine est présenté ci-dessous. Notez la distribution à peu près gaussienne des pics, dont chacun représente la protéine intacte avec des charges différant de +1. Les protéines ont des charges positives en raison à la fois de la protonation des chaînes latérales d'acides aminés ainsi que des charges induites pendant le processus d'électroparasitage lui-même. Sur la base de la séquence d'acides aminés de la myoglobine et de l'hypothèse que le pKa des chaînes latérales est le même dans la protéine que pour les acides aminés isolés, les charges nettes moyennes calculées d'apoMb seraient d'environ +30 à pH 3,5, +20 à pH 4,5, +9 à pH 6 et 0 à pH 7,8 (le pi calculé). Le spectre de masse ci-dessous a été réalisé par injection directe dans le MS d'apoMb dans 0,1% d'acide formique (pH 2,8). Les charges sur le peptide sont un résultat combiné des charges présentes sur le peptide avant l'électropulvérisation et des changements de charges induits au cours du processus. www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/...onisation.html. .

Figure : Spectre de masse ESI de l'apo-myoglobine

La masse moléculaire de la protéine peut être déterminée en analysant deux pics adjacents, comme le montre la figure ci-dessous.

Si M est la masse moléculaire de la protéine analyte et n est le nombre de charges positives sur la protéine représentées dans un pic m/z donné, alors les équations suivantes donnent la masse moléculaire M de la protéine pour chaque pic :

[Mcrête2 = n(m/z)crête 2 - n(1.008)]

[Mcrête1 = (n + 1) (m/z)crête 1 - (n +1) (1.008)]

où 1,008 est le poids atomique de H. Puisqu'il n'y a qu'une seule valeur de M, les deux équations peuvent être égales l'une à l'autre, ce qui donne :

[n(m/z)pic 2 - n(1.008) = (n + 1) (m/z)pic 1 - (n +1) (1.008)]

La résolution de n donne :

[n = [(m/z)pic 1 - 1,008]/[(m/z)pic 2 -(m/z)pic 1]. ]

Connaissant n, la masse moléculaire M de la protéine peut être calculée pour chaque pic m/z. La meilleure valeur de M peut ensuite être déterminée en faisant la moyenne des valeurs M déterminées à partir de chaque pic (16 956 à partir de la figure ci-dessus). Pour les pics de m/z de 893 à 1542, les valeurs calculées de n allaient de +18 à +10.

Ionisation par désorption laser assistée par matrice (MALDI) : dans cette technique, utilisée pour les biomolécules plus grosses comme les protéines et les polysaccharides, l'analyte est mélangé à un matériau de matrice absorbant. L'excitation laser est utilisée pour exciter la matrice, conduisant à un transfert d'énergie qui entraîne l'ionisation et le "lancement" de la matrice et de l'analyte sous forme d'ions à partir du mélange solide. Des pics d'ions parents de (M+H)+ et (M-H)- sont formés.

Analyseur de masse

Piège à ions quadripolaire (utilisé dans ESI) - Un mélange complexe d'ions peut être contenu (ou piégé) dans ce type d'analyseur de masse. Deux types courants sont les quadripôles linéaires et 3D.

Figure : Quadrupôles linéaires et 3D

Comme les dipôles affichent une séparation des charges positive et négative sur un axe linéaire, les quadripôles ont soit des charges électriques opposées, soit des champs magnétiques opposés aux extrémités opposées d'un carré ou d'un cube. En séparation de charge, le monopôle (somme des charges) et les dipôles s'annulent à zéro, mais pas le moment quadripolaire. Le quadripôle piège les ions en utilisant une combinaison de champs électriques fixes et alternatifs. Le piège contient He à 1 mTorr. Pour le piège 3D, l'électrode annulaire a une tension RF oscillante qui maintient les ions piégés. Les embouts ont également une tension alternative. Les ions oscillent dans le piège avec une fréquence "séculaire" déterminée par la fréquence de la tension RF, et bien sûr, le rapport m/z. En augmentant l'amplitude du champ RF à travers l'électron de l'anneau, le mouvement des ions dans le piège est déstabilisé et conduit à l'éjection d'ions dans le détecteur. Lorsque la fréquence séculaire du mouvement des ions correspond à la tension alternative appliquée aux électrodes du capuchon, une résonance se produit et l'amplitude du mouvement des ions augmente, permettant également une fuite du piège à ions dans le détecteur.

Tube à temps de vol (TOF) (utilisé dans MALDI) - un long tube est utilisé et le temps requis pour la détection des ions est déterminé. Les ions de faible masse moléculaire mettent le plus de temps à atteindre le détecteur.

Spectrométrie de masse en tandem (MS/MS)

Les analyseurs de masse quadripolaires qui peuvent sélectionner des ions de divers rapports m/z dans les pièges à ions sont couramment utilisés pour la spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Dans cette technique, les ions sélectionnés sont encore fragmentés en ions plus petits par un processus appelé dissociation induite par collision (CID). Lorsqu'elle est effectuée sur tous les ions initiaux présents dans le piège à ions, la séquence d'un peptide/protéine peut être déterminée. Cette technique nécessite généralement deux analyseurs de masse avec une cellule de collision intermédiaire où les ions sélectionnés sont fragmentés par collision avec un gaz inerte. Elle peut également être effectuée dans un seul analyseur de masse à l'aide d'un piège à ions quadripolaire.

Dans une expérience MS/MS typique pour déterminer une séquence protéique, une protéine est clivée en fragments de protéine avec une enzyme telle que la trypsine, qui clive du côté carboxyle des chaînes latérales Lys et Arg chargées positivement. La taille moyenne des protéines dans le protéome humain est d'environ 50 000. Si la masse moléculaire moyenne d'un acide aminé dans une protéine est d'environ 110 (18 soustraits puisque l'eau est libérée lors de la formation de liaisons amides), le nombre moyen d'acides aminés dans la protéine serait d'environ 454. Si 10 % des acides aminés sont Arg et Lys, il y aurait en moyenne environ 50 Lys et Arg, et donc 50 peptides tryptiques de masse moléculaire moyenne de 1000. Les fragments sont introduits dans le MS où une analyse d'empreinte de fragment peptidique peut être effectuée. Les PM des fragments peuvent être identifiés et comparés à des fragments connus de digestion peptidique provenant de protéines connues pour identifier la protéine analyte.

Pour obtenir des informations sur la séquence, un peptide tryptique avec un rapport m/z spécifique (de manière optimale avec une seule charge +1) est ensuite sélectionné dans le piège à ions et fragmenté lors de la collision avec un agent inerte (MS/MS). Étant donné que la gamme m/e des spectromètres de masse se compte en milliers, des fragments tryptiques avec une seule charge peuvent facilement être détectés et ciblés pour la MS/MS. Les clivages probables et observés pour un tétrapeptide et les ions résultants avec une charge +1 sont illustrés ci-dessous. Les ions avec l'extrémité N d'origine sont désignés par a, b et c, tandis que les ions avec l'extrémité C d'origine sont désignés par x, y et z. Les ions c et y obtiennent un proton supplémentaire du peptide pour former des groupes -NH3+ chargés positivement. Les ions réels observés dépendent de nombreux facteurs, notamment la séquence du peptide, sa charge d'origine, l'énergie de la collision induisant la fragmentation, etc. La fragmentation à basse énergie des peptides dans les pièges à ions produit généralement des ions a, b et y, ainsi que des ions pics résultant de la perte de NH3 (a*, b* et y*) ou H2O (ao, bo et yo). Aucun pic résultant de la fragmentation des chaînes latérales n'est observé. La fragmentation en deux sites du peptide (habituellement aux sites b et y du squelette) forme un fragment interne.

Figure : Fragmentation peptidique et séquençage par MS/MS

Le pic y1 représente la Lys ou Arg C-terminal (dans cet exemple) du peptide tryptique. Le pic y2 a un acide aminé supplémentaire par rapport à y1 et la différence de masse moléculaire identifie l'acide aminé supplémentaire. Le pic y3 est également un acide aminé plus grand que y2. Les trois pics des fragments y ont une extrémité C-terminale Lys/Arg commune et le fragment chargé contient l'extrémité C-terminale du peptide d'origine. Tous les pics de fragments b pour un peptide donné contiennent un acide aminé N terminal commun avec b1 le plus petit. Notez que l'indice représente le nombre d'acides aminés dans le fragment. En identifiant les pics b et y, la séquence réelle du petit peptide peut être déterminée. Habituellement, les spectres correspondent à des bases de données pour identifier la structure de chaque peptide et finalement celle de la protéine. Les valeurs m réelles pour les fragments peuvent être calculées comme suit, où (N est la masse moléculaire du groupe neutre N terminal, (C) est la masse moléculaire du groupe neutre c terminal, et (M) est la masse moléculaire du acides aminés neutres.

  • a : (N)+(M)-CHO
  • b : (N)+(M)
  • y : (C)+(M)+H (notez dans la figure ci-dessus que l'extrémité amino des peptides y a un proton supplémentaire dans les peptides chargés +1.)

Les valeurs m/z peuvent être calculées à partir des valeurs m calculées et en ajoutant la masse H au z global si la charge globale est de +1, etc.

Tableau : Masses de résidus d'acides aminés dans une protéine. (Pour l'acide aminé N terminal, ajoutez 1 H. pour l'extrémité C, ajoutez OH)

Résidu

Code

Masse monoisotopique

Masse moyenne

Ala

UNE

71.0779

Arg

R

156.101111

156.1857

Asn

N

114.042927

114.1026

Aspic

115.026943

115.0874

Cys

C

103.009185

103.1429

glu

E

129.042593

129.114

Gln

Q

128.058578

128.1292

Gly

g

57.0513

Le sien

H

137.058912

137.1393

Ile

je

113.084064

113.1576

Leu

L

113.084064

113.1576

Lys

K

128.092963

128.1723

Rencontré

M

131.040485

131.1961

Phe

F

147.068414

147.1739

Pro

P

97.1152

Ser

S

87.0773

Thr

T

101.047679

101.1039

Trp

W

186.079313

186.2099

Tyr

Oui

163.06332

163.1733

Val

V

99.1311

A titre d'exemple, avec ces valeurs de PM, la séquence du Glu1-fibrinopeptide B humain peut être déterminée à partir des spectres MS/MS présentés sous une forme annotée ci-dessous. Notez que la plupart des pics b sont b* résultant de la perte de NH3 de l'extrémité N.

Figure : Spectres MS/MS annotés du Glu1-fibrinopeptide B humain


12.4 : Interprétation des spectres de masse

Lors de l'interprétation des schémas de fragmentation, vous trouverez peut-être utile de savoir que, comme vous pouvez vous y attendre, les liaisons carbone-carbone les plus faibles sont les plus susceptibles de se rompre. Vous pouvez vous référer au tableau des énergies de dissociation des liaisons lorsque vous tentez des problèmes impliquant l'interprétation des spectres de masse.

Cette page examine comment les motifs de fragmentation se forment lorsque des molécules organiques sont introduites dans un spectromètre de masse, et comment vous pouvez obtenir des informations à partir du spectre de masse.


INTRODUCTION

Les progrès technologiques spectaculaires des sciences biologiques au cours des dernières années ont forgé une nouvelle ère de recherche, y compris le domaine émergent de la biologie des systèmes. Bien que la compréhension des organismes vivants au niveau du système moléculaire en soit encore à ses balbutiements, il est évident que des études approfondies de la cascade de la bande dessinée avec la génomique, la transcriptomique, la protéomique et la métabolomique sont des éléments constitutifs importants et joueront un rôle central. dans cette nouvelle science (voir Fig. 1 ). L'analyse intégrative de la réponse d'un organisme à une perturbation des niveaux du transcriptome, du protéome et du métabolome conduira à une meilleure compréhension des mécanismes biochimiques et biologiques dans les systèmes complexes. Cependant, alors que la génomique, la transcriptomique et la protéomique ont fait des progrès significatifs dans le développement technologique, les outils pour l'examen complet du métabolome sont encore en train d'émerger (Bino et al., 2004). Bien que la métabolomique soit le critère d'évaluation de la "cascade de la bande dessinée" et qu'elle soit la plus proche du phénotype, il n'existe actuellement aucune plate-forme à instrument unique capable d'analyser tous les métabolites. Peut-être, parce qu'il y a au moins la perception que les autres approches “omic” peuvent être gérées par une seule plate-forme, la métabolomique a pris du retard par rapport aux autres technologies. Ceci est illustré à la Figure 2, montrant la recherche bibliographique contenant les mots métabolomique, métabonomie et protéomique dans Chemical Abstracts Plus (SciFinder Scholar). Alors qu'en 1999 trois articles contenant les mots-clés métabolomique ou métabonomie ont été publiés, le nombre est passé à 147 articles en 2003 et 203 en 2004. De plus, la revue Métabolomique (Springer) a été récemment lancé, qui se consacre à la publication des résultats de recherche liés au développement de la technologie métabolomique, à l'analyse et au stockage des données, aux études intégrées avec d'autres techniques de « comics » et aux applications métabolomiques. Le nombre croissant de publications dans le domaine démontre que la métabolomique n'est pas seulement un nouveau mot de « comics » mais un outil émergent précieux pour étudier le phénotype et les changements de phénotype causés par des influences environnementales, des maladies ou des changements de génotype. L'étude approfondie du métabolome est compliquée par son énorme complexité et sa dynamique. Les distributions des métabolites sont soumises à une forte variabilité temporelle et spatiale, par exemple, les fluctuations circadiennes chez les mammifères sont bien connues. De plus, la variabilité biologique dépendante du régime alimentaire dans les systèmes mammifères peut compliquer l'analyse (Vigneau-Callahan et al., 2001). Une conception expérimentale minutieuse est donc indispensable pour le succès de ces types d'enquêtes. Le métabolome représente un grand nombre de composants qui appartiennent à une grande variété de classes de composés, tels que les acides aminés, les lipides, les acides organiques, les nucléotides, etc. Ces composés sont très divers dans leurs propriétés physiques et chimiques et se présentent dans une large gamme de concentrations . Par exemple, dans les lipides seuls, non seulement des composés à forte abondance, tels que les acides gras, les triglycérides ou les phospholipides, sont rencontrés, mais aussi des composants à l'état de traces avec des effets régulateurs importants, tels que les eicosanoïdes dérivés de l'acide arachidonique. Selon Beecher, 2 000 métabolites majeurs semblent être une bonne estimation pour l'homme (Beecher, 2003). Ce nombre peut bien sûr être considérablement plus grand si l'on considère les métabolites secondaires. Certains de ces métabolites peuvent être des médiateurs chimiques d'une grande importance biologique. Jusqu'à 200 000 métabolites peuvent être rencontrés dans le règne végétal (Weckwerth, 2003). Par conséquent, l'étude du métabolome est un défi majeur pour la chimie analytique et une analyse métabolomique au sens propre, à savoir l'analyse quantitative de tous les métabolites, ne peut être réalisée avec l'instrumentation analytique actuelle.

La cascade “Omics” comprend des ensembles de données complexes qui, en tant qu'entité, décrivent de manière exhaustive la réponse des systèmes biologiques aux maladies, aux perturbations génétiques et environnementales. La base de données la plus puissante intégrera les données de tous les niveaux omiques. Cependant, parmi ces bases de données, le métabolome est le plus prédictif du phénotype.

Recherche bibliographique dans Chemical Abstracts Plus contenant les mots-clés métabolomique et métabonomie à l'aide de SciFinder Scholar (au 10 juin 2005). Au total, 696 articles de revues ont été trouvés. L'ensemble de données a été approfondi à l'aide du paramètre de recherche spectrométrie de masse ou RMN. Le diagramme montre la fréquence des publications en métabolomique totale (carrés noirs), publications qui mentionnent la spectrométrie de masse (barres noires) et la RMN (barres grises) de 1999 à 2004.

Actuellement, deux approches complémentaires sont utilisées pour les investigations métabolomiques : le profilage métabolique et l'empreinte métabolique (voir Fig. 3) (Dettmer & Hammock, 2004). Un résumé des définitions liées à la métabolomique est présenté dans le tableau 1 . Le profilage métabolique se concentre sur l'analyse d'un groupe de métabolites liés soit à une voie métabolique spécifique, soit à une classe de composés. L'analyse quantitative d'acides gras sous forme d'esters méthyliques d'acides gras par GC-FID (détection par ionisation de flamme) ou l'analyse d'acides aminés sont des exemples de profilage métabolique. Une approche encore plus ciblée est l'analyse de cibles qui vise à mesurer des analytes sélectionnés, tels que des biomarqueurs de maladies ou d'exposition à des substances toxiques, ou des substrats et produits de réactions enzymatiques (Fiehn, 2002). Dans la plupart des cas, le profilage métabolique est une approche fondée sur des hypothèses plutôt que génératrice d'hypothèses. Sur la base des questions posées, les métabolites sont sélectionnés pour analyse et des méthodes analytiques spécifiques sont développées pour leur détermination. Les énormes progrès technologiques au cours des dernières années permettent une augmentation constante du nombre d'analytes qui sont quantifiés simultanément dans une seule analyse. Technologiquement, l'analyse d'un seul biomarqueur est souvent aussi complexe que le profilage de tous les métabolites clés associés dans une voie biochimique donnée. Cependant, ces derniers résultats donneront une description plus complète et détaillée des perturbations métaboliques qu'un seul biomarqueur ne peut le fournir. Les résultats du profilage métabolique sont quantitatifs et idéalement indépendants de la technologie utilisée pour l'acquisition des données. Par conséquent, les données peuvent être utilisées pour créer des bases de données pouvant être intégrées à des cartes de voies ou à d'autres données de « comics » qui amélioreront la compréhension biologique. Bien que les données quantitatives sur les métabolites provenant de différents organismes modèles soient abondantes dans la littérature, leur intégration dans les bases de données mondiales n'a pas encore été accomplie.

Stratégies pour les investigations métabolomiques.

TABLEAU 1

MétabolitePetites molécules qui participent aux réactions métaboliques générales et qui sont nécessaires au maintien, à la croissance et au fonctionnement normal d'une cellule * .
MétabolomeL'ensemble complet des métabolites dans un organisme.
MétabolomiqueIdentification et quantification de tous les métabolites dans un système biologique.
Profilage métaboliqueAnalyse quantitative d'un ensemble de métabolites dans une voie biochimique sélectionnée ou une classe spécifique de composés. Cela comprend l'analyse de la cible, l'analyse d'un nombre très limité de métabolites, par ex. analytes isolés comme précurseurs ou produits de réactions biochimiques.
Empreintes métaboliquesApproche de criblage globale et impartiale pour classer les échantillons en fonction de modèles de métabolites ou d'empreintes digitales qui changent en réponse à une maladie, à des perturbations environnementales ou génétiques dans le but ultime d'identifier des métabolites discriminants.
Empreinte métaboliqueAnalyse des empreintes digitales des métabolites extracellulaires dans le milieu de culture cellulaire en tant que reflet de l'excrétion ou de l'absorption des métabolites par les cellules.

L'inconvénient du profilage métabolique est que le système n'est pas une approche globale ou vraie de “omics”. Cependant, de nombreuses méthodes de profilage métabolique quantitatif analysant différentes classes de métabolites ont déjà été développées et sont couramment utilisées. Si ces méthodes mesurant les métabolites clés de différentes voies biochimiques sont assemblées en tant que blocs de construction pour étudier le métabolome, une puissante approche métabolomique évoluera.

La deuxième approche de la métabolomique est l'empreinte métabolique. Initialement, dans cette approche, l'intention n'est pas d'identifier chaque métabolite observé, mais de comparer les modèles ou les empreintes digitales des métabolites qui changent en réponse à une maladie, à une exposition à des toxines, à des altérations environnementales ou génétiques. Un flux de travail typique, mais simplifié pour une analyse d'empreintes métaboliques est illustré à la figure 4 . L'empreinte métabolique a été réalisée dans une grande variété de matrices biologiques, telles que l'urine, le plasma ou le sérum, la salive et les tissus ou cellules. En plus de l'empreinte métabolique des métabolites intracellulaires dans les systèmes de culture cellulaire, l'analyse des métabolites extracellulaires excrétés dans le milieu de culture ou prélevés du milieu par les cellules peut fournir des informations précieuses sur leur phénotype et leur état physiologique. L'analyse des modèles de métabolites dans les milieux de culture cellulaire conditionnés est appelée empreinte métabolique (Allen et al., 2003, 2004). Étant donné que les empreintes métaboliques peuvent être appliquées simultanément à un large éventail de métabolites, il s'agit d'une véritable approche « de la bande dessinée ». La mise en œuvre des empreintes métaboliques basées sur la résonance magnétique nucléaire (RMN) a marqué le début d'une approche métabolomique en tant qu'outil en biochimie et s'est avérée extrêmement puissante dans le criblage d'échantillons pour une variété de modèles de signature ou de groupes. L'empreinte métabolique peut être utilisée comme outil de diagnostic, par exemple, en évaluant l'empreinte métabolique d'un patient par rapport à des sujets sains et malades. De plus, le succès des stratégies de traitement peut être surveillé en observant si le phénotype métabolique revient à l'état sain, ou en d'autres termes si un échantillon après traitement tombe dans le groupe de sujets sains. Cependant, utiliser la métabolomique exclusivement pour les empreintes digitales sans identifier les métabolites qui provoquent le regroupement des groupes expérimentaux ne fournira qu'un outil de classification, mais ne contribuera pas directement à la connaissance biochimique et à la compréhension des mécanismes d'action sous-jacents. La puissance réelle de la métabolomique est réalisée lorsque des analyses qualitatives et quantitatives sont effectuées. La connaissance de l'identité des métabolites et de leur perturbation quantitative en tant que descripteurs de différences dans des phénotypes spécifiques fournira des informations pouvant être interprétées à la lumière des voies biochimiques. Par conséquent, les métabolites provoquant la ségrégation des groupes dans l'approche d'empreintes digitales doivent être identifiés et des méthodes quantitatives pour l'analyse de ces métabolites et des composés apparentés doivent être développées, qui relieront les empreintes digitales métaboliques et le profilage. Par conséquent, l'annotation du métabolome est un élément important pour des études métabolomiques réussies.

Flux de travail simplifié pour une analyse d'empreintes métaboliques.

Les empreintes métaboliques et le profilage peuvent être utilisés dans la recherche de nouveaux biomarqueurs. La valeur des tests de glycémie et de cholestérol dans les diagnostics médicaux illustre la valeur de biomarqueurs même simples. La métabolomique peut produire de nouveaux biomarqueurs pouvant atteindre la clinique en tant qu'outils pour diagnostiquer l'état de santé, la maladie ou le résultat d'un traitement pharmacologique. La métabolomique ne se limite pas aux biomarqueurs individuels. Il s'agit plutôt d'une nouvelle approche du diagnostic où de grands ensembles de données peuvent être utilisés au total pour développer la compréhension. Par exemple, l'évaluation des voies biochimiques associées en réponse à un traitement médicamenteux donnera une description plus complète des mécanismes de rétroaction ou de la diaphonie que les biomarqueurs seuls peuvent fournir. De plus, le concept de santé individualisée incluant la nutrition mais aussi le traitement pharmacologique sur mesure basé sur le phénotype métabolique s'appuiera fortement sur la technologie métabolomique (Watkins & German, 2002). La promesse de la technologie en médecine clinique de passer d'échantillons de millilitres à microlitres et de passer de quelques-uns à des milliers d'analytes est passionnante, mais le potentiel de la technologie pour générer une compréhension biologique est peut-être encore plus important.

De nombreuses plateformes analytiques ont été utilisées pour des applications métabolomiques, telles que la RMN (Nicholson & Wilson, 2003), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-IR) (Harrigan et al., 2004 Johnson et al., 2004) et la spectrométrie de masse (MS) couplée à des techniques de séparation, ou utilisant l'injection en flux direct. Les grands avantages de la RMN sont le potentiel de prise d'empreintes à haut débit, les exigences minimales pour la préparation des échantillons et la nature non discriminante et non destructive de la technique. Cependant, seuls les métabolites d'abondance moyenne à élevée seront détectés avec cette approche et l'identification des métabolites individuels sur la base des signaux de déplacement chimique qui provoquent le regroupement des échantillons dans l'analyse multivariée est difficile dans les mélanges complexes. La métabolomique basée sur la spectrométrie de masse offre des analyses quantitatives avec une sélectivité et une sensibilité élevées et le potentiel d'identifier des métabolites. La combinaison avec une technique de séparation réduit la complexité des spectres de masse dus à la séparation des métabolites dans une dimension temporelle, fournit une séparation isobare et fournit des informations supplémentaires sur les propriétés physico-chimiques des métabolites. Cependant, les techniques basées sur la spectrométrie de masse nécessitent généralement une étape de préparation de l'échantillon, ce qui peut entraîner des pertes de métabolites, et en fonction du système d'introduction de l'échantillon et de la technique d'ionisation utilisée, des classes de métabolites spécifiques peuvent être discriminées. Par conséquent, l'application parallèle de plusieurs techniques, par exemple la GC-MS et la LC-MS, est souhaitée pour étudier le métabolome de manière exhaustive. Actuellement, la métabolomique basée sur la spectrométrie de masse est un domaine en émergence dynamique avec un nombre de publications annuelles dépassant les enquêtes publiées basées sur la RMN (voir Fig. 2).

Cependant, non seulement le choix des techniques analytiques nécessite un examen attentif, mais l'ensemble de l'expérience de métabolomique doit être planifié comme une unité intégrée, car les données instrumentales sont aussi bonnes que la conception expérimentale et le traitement de l'échantillon. Dans ce contexte Bino et al. (2004) ont proposé, les informations minimales sur une expérience de métabolomique (MIAMET), qui devraient être rapportées avec chaque étude afin de faciliter l'échange d'informations et la constitution de bases de données. Des recommandations similaires concernant les métadonnées ont été faites pour les autres technologies de “omics”.

En général, pour chaque type d'expérience de métabolomique basée sur la SM, les étapes suivantes doivent être abordées lors du développement et de la validation de la méthode :

Analyse d'échantillons, y compris la séparation des métabolites et la détection MS,


Spectrométrie de masse

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Méthodes de traitement pour la détermination de ?? 2 heures et ?? 18 O de kératine capillaire par spectrométrie de masse isotopique en flux continu

Les protéines structurelles qui composent ∼ 90 % des poils d'animaux ont le potentiel d'enregistrer des variations déterminées par l'environnement et la physiologie de ?? 2 heures et ?? Valeurs 18 O de l'eau corporelle. La variation géospatiale large, systématique des isotopes stables de l'hydrogène et de l'oxygène de l'eau environnementale et la capacité de mesure rapide et précise via des méthodes telles que l'analyseur élémentaire de conversion à haute température/spectrométrie de masse du rapport isotopique (TC/EA-IRMS) rendent ces systèmes isotopiques particulièrement bien adapté aux applications nécessitant la géolocalisation d'échantillons de cheveux. Pour que de telles applications réussissent, cependant, des méthodes doivent exister pour la détermination précise des cheveux ?? 2 heures et ?? 18 O valeurs reflétant les produits primaires de la biosynthèse. Nous présentons ici les résultats d'expériences conçues pour examiner deux imprécisions potentielles affectant ?? 2 heures et ?? Mesures 18 O des cheveux : la contribution de l'hydrogène et de l'oxygène non biologiques aux échantillons sous forme d'eau moléculaire sorbée, et l'échange d'hydrogène lié aux hydroxyles entre la kératine des cheveux et la vapeur d'eau ambiante. Nous montrons que la sorption rapide de l'eau moléculaire de l'atmosphère peut avoir un effet substantiel sur ?? 2 heures et ?? valeurs de 18 O des cheveux (comprenant ∼7,7% du signal isotopique mesuré pour H et jusqu'à ∼10,6% pour O), mais que cette contribution peut être efficacement éliminée par séchage sous vide des échantillons pendant 6 jours. L'échange d'hydrogène entre la kératine des cheveux et la vapeur ambiante est également rapide (atteignant l'équilibre en 3 à 4 jours), avec 9 à 16 % de l'hydrogène total disponible pour l'échange à température ambiante. Sur la base des résultats de ces expériences, nous décrivons une procédure de traitement d'échantillon recommandée pour la mesure de routine de ?? 2 heures et ?? 18 O dans les poils de mammifères. Copyright © 2005 John Wiley & Sons, Ltd.


Déclarations éthiques

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent une collaboration continue avec Protein Metrics pour établir une plate-forme de traitement de données HDX, un sujet qui n'est pas lié à ce protocole. La recommandation d'utiliser Protein Metrics comme logiciel de traitement de données préféré pour les données FPOP est antérieure à la collaboration en cours. M.L.G. est un membre non rémunéré du conseil consultatif scientifique de GenNext Technologies, qui fournit des produits et des services pour l'empreinte des radicaux hydroxyles.


Histoire

Les fondations de la spectroscopie de masse ont été posées en 1898, lorsque Wilhelm Wien, un physicien allemand, a découvert que des faisceaux de particules chargées pouvaient être déviés par un champ magnétique. Dans des expériences plus raffinées menées entre 1907 et 1913, le physicien britannique J.J. Thomson, qui avait déjà découvert l'électron et observé sa déviation par un champ électrique, a fait passer un faisceau d'ions chargés positivement à travers un champ électrostatique et magnétique combiné. Les deux champs dans le tube de Thomson étaient situés de manière à ce que les ions soient déviés selon de petits angles dans deux directions perpendiculaires. Le résultat net était que les ions produisaient une série de courbes paraboliques sur une plaque photographique placée sur leur trajectoire. Chaque parabole correspondait à des ions d'un rapport masse/charge particulier, la position spécifique de chaque ion dépendant de sa vitesse. Les longueurs des courbes paraboliques fournissaient une mesure de la gamme d'énergies ioniques contenues dans le faisceau. Later, in an attempt to estimate the relative abundances of the various ion species present, Thomson replaced the photographic plate with a metal sheet in which was cut a parabolic slit. By varying the magnetic field, he was able to scan through a mass spectrum and measure a current corresponding to each separated ion species. Thus he may be credited with the construction of the first mass spectrograph and the first mass spectrometer.

The most noteworthy observation made with the parabola spectrography was the spectrum of rare gases present in the atmosphere. In addition to lines due to helium (mass 4), neon (mass 20), and argon (mass 40), there was a line corresponding to an ion of mass 22 that could not be attributed to any known gas. The existence of forms of the same element with different masses had been suspected since it had been found that many pairs of radioactive materials could not be separated by chemical means. The name isotope (from the Greek for “same place”) was suggested by the British chemist Frederick Soddy in 1913 for these different radioactive forms of the same chemical species, because they could be classified in the same place in the periodic table of the elements. The ion of mass 22 was, in fact, a stable heavy isotope of neon.


<p>This section provides information on the quaternary structure of a protein and on interaction(s) with other proteins or protein complexes.<p><a href='/help/interaction_section' target='_top'>More. </a></p> Interaction i

<p>This subsection of the <a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">'Interaction'</a> section provides information about the protein quaternary structure and interaction(s) with other proteins or protein complexes (with the exception of physiological receptor-ligand interactions which are annotated in the <a href="http://www.uniprot.org/help/function%5Fsection">'Function'</a> section).<p><a href='/help/subunit_structure' target='_top'>More. </a></p> Subunit structure i

Homo/heterodimer, or complexes of higher-order. The structure of beta-crystallin oligomers seems to be stabilized through interactions between the N-terminal arms (By similarity).

<p>This subsection of the '<a href="http://www.uniprot.org/help/interaction%5Fsection">Interaction</a>' section provides information about binary protein-protein interactions. The data presented in this section are a quality-filtered subset of binary interactions automatically derived from the <a href="https://www.ebi.ac.uk/intact/">IntAct database</a>. It is updated at every <a href="http://www.uniprot.org/help/synchronization">UniProt release</a>.<p><a href='/help/binary_interactions' target='_top'>More. </a></p> Binary interactions i

P43320

GO - Molecular function i

Protein-protein interaction databases

The Biological General Repository for Interaction Datasets (BioGRID)

Protein interaction database and analysis system

Molecular INTeraction database

STRING: functional protein association networks

Bases de données diverses

RNAct, Protein-RNA interaction predictions for model organisms.


The basics of mass spectrometry

Since their inception in 1912, mass spectrometers have undergone continuous development, and these sophisticated bioanalytical instruments have now reached unrivalled detection limits, speed and diversity in applications. They detect the presence and abundance of peptides (or other biomolecules such as metabolites, lipids and proteins) using fundamental properties of molecules, such as mass, and net charge. When peptides obtain a net charge (usually through gain of protons), they are referred to as peptide ions.

All mass spectrometers have three fundamental components: an ion source, mass analyser and detector (Figure 1A). As mass spectrometers can only analyse gaseous ions, methods such as electrospray ionization (ESI) are needed to convert peptides from the liquid phase to gaseous ions. The liquid containing the peptides is pumped through a micrometre-sized orifice held at a high voltage (2–4 kV). Upon reaching this emitter, the steady stream of liquid disintegrates into extremely small, highly charged and rapidly evaporating charged droplets, leaving peptide ions in the gas phase. Even 20 years after John Fenn received the Nobel Prize for this discovery, the exact mechanisms are not completely understood. We know that the abundance of gaseous peptide ions is proportional to their original concentration, making it beneficial to use the lowest flow rates possible, thereby maximizing sensitivity. It is common in proteomics to separate peptide mixtures using high-performance liquid chromatography (HPLC) systems with flow rates of only a few hundred nanolitres per minute rather than millilitres in conventional HPLC.

Overview of sample preparation and instrumentation used in MS-based proteomics. (UNE) Proteins are digested into peptides using sequence-specific proteases. Optionally, post-translational modification (PTM)-containing peptides can be enriched using beads with specific surface chemistry or coupled antibodies. High-performance liquid chromatography (HPLC) separates peptides based on hydrophobicity, and they are subsequently analysed by a TOF mass spectrometer. (B) Alternatively, peptides can be analysed by an Orbitrap mass spectrometer, which is a mainstream instrument in proteomics.

The principal role of a mass analyser is to separate ions by their mass-to-charge ratios (m/z). Fundamentally, all ions are separated by modulating their trajectories in electrical fields. Mass analysers differ in the principle they use for separating ions, and this defines their preferred application areas. Quadrupoles, usually combined with time-of-flight (TOF) or Orbitrap analysers, are the most common in proteomics. Quadrupole mass analysers separate ions using an oscillating electrical field between four cylindrical rods in a parallel arrangement, where each pair of rods produces a radio frequency electrical field with a phase offset. The resulting electrical fields define a pseudo-potential surface that is configured to allow the transmission of all ions, or to selectively transmit ions of a specific m/z window.

TOF mass analysers separate ions based on the differences in velocities after acceleration to about 20 kV and subsequent different arrival times at the detector. A TOF can measure mass differences of one part per million (ppm) by detecting time differences of sub-microseconds. In contrast, the Orbitrap mass analyser distinguishes ions based on their oscillation frequencies. Ions are tangentially injected and then trapped in the Orbitrap, and they move along the length axis of a central metal spindle (Figure 1B). Although an Orbitrap is only a few centimetres long, the ions can rapidly travel up to several kilometres, enabling very high resolution (typically tens of thousands) and low ppm mass accuracy.

In proteomics, the quadrupole element is normally followed by a ‘collision cell’, which is a quadrupole where the ions can be fragmented. Either intact peptide ions or fragment ions enter the final stage that also contains the detector – the resulting spectra are called MS 1 or precursor ion spectra in the former case and MS 2 or product or MS/MS spectra in the latter. TOF instruments have microchannel plate (MCP) detectors, where each individual ion ejects electrons from a surface that are then amplified. Individual ions can be readily measured with MCPs, but this exquisite sensitivity comes with the caveat that the detector can easily saturate in case of high signals. In Orbitrap analysers, the ‘image current’ induced by the rapidly oscillating ions is measured, and it represents a quantitative readout of the strength of the individual ion packages. The current is recorded in the time domain and is converted into the frequency domain using Fourier transformation. Advances in signal processing algorithms have repeatedly doubled the achievable resolution with a given transient time of the signal, but these are still orders of magnitude slower than those of TOF analysers (tens to hundreds of milliseconds vs typically 100 microseconds for a single TOF pulse).

How do the MS instruments sequence or identify peptides? Precursor ions with a specific m/z are first isolated by the quadrupole and fragmented through collision with inert gases such as N2, He or Ar. This causes them to break apart at the lowest energy bonds – typically, some of the amide bonds (peptide bonds) connecting the amino acid residues – and leaves MS/MS spectra with incomplete ladders of peaks differing by amino acid masses. This information is incredibly specific and is used for identification of the peptide sequence. A sequence of just a few amino acids and the flanking masses – a peptide sequence tag – is sufficient for identifying a peptide from the entirety of human proteome. More usually, database identification involves generating all possible fragmentation spectra and then statistically scoring them against the experimental spectra.

The chromatographic retention time is an important level of information when matching a dataset against a previous measurement and is key to ‘targeted proteomics’ technologies. Furthermore, ion mobility analysis, an additional dimension of separation of peptide ions, has recently become mainstream. Ions are either filtered based on their cross-section (FAIMS, field asymmetric ion mobility spectrometry) or actually separated during their analysis (T-Wave or TIMS, trapped ion mobility spectrometry). TIMS is the basis of the parallel accumulation–serial fragmentation (PASEF) technology, which multiplies sequencing speed 10-fold while improving sensitivity.


Institut Large

Mass spectrometry is an analytical tool useful for measuring the mass-to-charge ratio (m/z) of one or more molecules present in a sample. These measurements can often be used to calculate the exact molecular weight of the sample components as well. Typically, mass spectrometers can be used to identify unknown compounds via molecular weight determination, to quantify known compounds, and to determine structure and chemical properties of molecules.

How does a mass spectrometer perform such a feat? Every mass spectrometer consists of at least these three components:

1. The Ionization Source

Molecules are converted to gas-phase ions so that they can be moved about and manipulated by external electric and magnetic fields. In our laboratory we use a technique called nanoelectrospray ionization, which is somewhat similar to how cars are industrially painted. This method allows for creating positively or negatively charged ions, depending on the experimental requirements. Nanoelectrospray ionization can directly couple the outlet of a small-scale chromatography column directly to the inlet of a mass spectrometer. The flow from the column is passed through a needle that is 10-15 um at its tip.

2. The Mass Analyzer

Once ionized, the ions are sorted and separated according to mass-to-charge (m/z) rapports. There are a number of mass analyzers currently available, each of which has trade-offs relating to speed of operation, resolution of separation, and other operational requirements. The specific types in use at the Broad Institute are discussed in the next section. The mass analyzer often works in concert with the ion detection system.

3. Ion Detection System

The separated ions are then measured and sent to a data system where the m/z ratios are stored together along with their relative abundance. UNE mass spectrum is simply the m/z ratios of the ions present in a sample plotted against their intensities. Each peak in a mass spectrum shows a component of unique m/z in the sample, and heights of the peaks connote the relative abundance of the various components in the sample.