Informations

Qu'est-ce qui détermine la quantité de données que vous obtiendriez d'une expérience de séquençage ?

Qu'est-ce qui détermine la quantité de données que vous obtiendriez d'une expérience de séquençage ?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Lorsqu'une personne effectue une expérience de séquençage, qu'est-ce qui détermine la quantité de données de séquençage que vous obtenez de la machine (Illumina, PacBio, Nanopore, etc.). Ou peut-être, en d'autres termes, comment la machine sait-elle que c'est fait ?


Sur une machine Illumina, l'instrument exécute autant de cycles que vous le lui demandez. Si vous lui dites d'exécuter 150 cycles, vous obtiendrez 150-mers en sortie.


Bases du séquençage

Le séquençage fluorescent automatisé utilise une variante du protocole de terminaison de chaîne Sanger développé il y a plus de 20 ans. Dans cette méthode, l'ADN à séquencer agit comme une molécule matrice à laquelle un court oligonucléotide complémentaire (amorce) s'hybridera pour commencer l'extension enzymatique et l'amplification d'une région spécifique d'ADN double brin. Les fragments nouvellement créés seront complémentaires de l'ADN matrice. Ce processus a lieu pendant la réaction de séquençage du cycle, un processus que chaque échantillon que nous recevons doit subir afin de devenir amplifié et marqué par fluorescence pour la détection sur nos séquenceurs.

Dans cette réaction de séquençage en cycle, la matrice et l'amorce sont combinées avec un mélange réactionnel composé de dNTP, de ddNTP marqués par fluorescence, de l'enzyme polymérase Amplitaq FS et d'un tampon. La réaction de séquençage du cycle est composée de trois étapes - dénaturation, recuit et extension - et se déroule dans un thermocycleur, un instrument qui permet de contrôler le chauffage et le refroidissement de nos réactions. Ces étapes sont répétées pendant 35 cycles pour assurer une amplification suffisante de l'ADN marqué, et prennent environ 3 1/2 heures pour terminer.

Au cours de l'étape de dénaturation, qui se produit à 96 °C, l'ADN matrice double brin est d'abord séparé en molécules simple brin. Au stade de l'annelage, la température est abaissée à 50 °C afin que les petites molécules d'amorce puissent trouver leurs régions complémentaires sur l'ADN matrice désormais simple brin et s'hybrider ou s'hybrider correctement. La température est ensuite élevée à 60 °C (étape d'extension) pour permettre à l'enzyme polymérase Taq de commencer l'incorporation de nucléotides dans les chaînes en croissance de fragments nouvellement créés qui sont complémentaires de l'ADN matrice simple brin. Ces produits d'extension commencent à la fin de l'amorce et s'étendent dans la direction 3'. La terminaison de la chaîne se produit pendant cette étape d'extension. Notre mélange réactionnel contient un mélange de désoxynucléotides (dNTP) et de didésoxynucléotides (ddNTP), à des concentrations qui créent une probabilité statistique qu'un didésoxynucléotide soit incorporé au lieu d'un désoxynucléotide à chaque position de nucléotide dans les fragments nouvellement générés. Lorsqu'un dNTP est incorporé, le nouveau fragment continuera de croître. Un ddNTP contient un atome d'hydrogène au lieu d'un groupe hydroxyle à son extrémité 3' et ne peut pas participer à une extension ultérieure. Par conséquent, lorsqu'un ddNTP est incorporé, un allongement supplémentaire de la chaîne est bloqué et cela se traduit par une population de produits tronqués de longueurs variables.

Lorsqu'ils sont séparés par électrophorèse, une "échelle" de ces produits tronqués se formera, chacun différant en taille d'un nucléotide, les plus petits fragments terminés s'exécutant le plus rapidement sur le gel. Il existe quatre ddNTP différents qui correspondent à chacun des quatre nucléotides d'ADN, et chaque ddNTP a une couleur différente. Ainsi, chaque fragment tronqué contiendra un ddNTP marqué par fluorescence à son extrémité 3', et l'échelle de séquençage sera composée de bandes colorées. La séquence peut ensuite être déterminée en corrélant la couleur d'une bande sur le gel avec son ddNTP spécifique, et l'ordre dans lequel elles se sont déroulées sur le gel. Ainsi, la première et la plus petite bande visualisée correspondra au premier nucléotide marqué incorporé immédiatement à côté de l'amorce. La deuxième bande sera constituée des fragments constitués d'un dNTP non marqué et d'un ddNTP marqué qui ont terminé ces chaînes en croissance particulières. La troisième bande sera composée de 2 dNTPS non marqués suivis de 1 ddNTP marqué, et ainsi de suite jusqu'au gel.

Une fois l'échantillon amplifié et marqué, il doit être soumis à une électrophorèse pour la séparation des fragments marqués et leur visualisation. Comme mentionné précédemment, les ddNTP sont marqués par fluorescence. Les colorants attachés sont des colorants à transfert d'énergie et consistent en un colorant donneur d'énergie fluorescéine lié à un colorant dichlororhodamine accepteur d'énergie. Ce système de transfert d'énergie est beaucoup plus sensible qu'un système à colorant unique et nous permet d'utiliser moins d'ADN pour la détection et, en plus, nous permet maintenant de séquencer de très grosses molécules d'ADN, telles que les BAC, les PAC et même certains ADN génomique bactérien, qui auparavant, les méthodes moins sensibles étaient incapables de gérer.

Ces fragments marqués par colorant sont chargés sur les séquenceurs et pendant l'électrophorèse, migrent soit à travers le gel de polyacrylamide soit le polymère liquide et sont séparés en fonction de leur taille. Vers la fin du gel ou du capillaire, ils traversent une région qui contient une fenêtre de lecture, derrière laquelle un faisceau laser passe en va-et-vient derrière les échantillons en migration. Ce laser excite les colorants fluorescents attachés aux fragments et ils émettent alors de la lumière à une longueur d'onde spécifique pour chaque colorant. Cette lumière émise est séparée en fonction de la longueur d'onde par un spectrographe sur un dispositif refroidi à couplage de charge ou une caméra CCD, de sorte que les quatre émissions fluorescentes puissent être détectées par un seul passage laser. Le logiciel de collecte de données collecte ces intensités lumineuses de la caméra CCD sur des bandes de longueurs d'onde particulières, ou des filtres virtuels, et les stocke sur l'ordinateur du séquenceur en tant que signaux numériques pour le traitement. Le logiciel d'analyse interprète ensuite l'intensité de fluorescence à chaque point de données et attribue ses interprétations d'appel de base.

Instrumentation dans notre laboratoire

Le laboratoire de séquençage d'ADN de Roswell Park utilise actuellement deux analyseurs génétiques ABI PRISM 3130XL. Ce sont des séquenceurs d'ADN capillaire automatisés fabriqués par Applied Biosystems. Chaque 3130 utilise une matrice de 16 capillaires, qui peut exécuter 176 échantillons en 24 heures en utilisant notre configuration actuelle ou jusqu'à 384 échantillons en 24 heures avec un protocole qui donne des longueurs de lecture plus courtes, mais permet un débit maximal.

Avec le 3130, le chargement de l'échantillon est basé sur l'injection électrocinétique. Lorsqu'une plaque d'échantillons est placée sur le pont de chargement de l'instrument, le réseau de 16 capillaires plonge dans les seize premiers puits d'échantillon, une tension est appliquée et des ions chargés négativement, qui sont principalement les produits d'extension de l'ADN mais qui peuvent également inclure des substances interférentes telles que sels, sont injectés dans le réseau capillaire. C'est l'une des raisons pour lesquelles l'ADN doit être particulièrement propre pour les analyses sur le 3130, car des ions plus petits chargés négativement, tels que des sels, sont injectés de préférence et peuvent interférer avec la migration des fragments d'ADN.

Un polymère s'écoulant liquide traverse les 16 capillaires de la matrice pour agir en tant que matrice de séparation. Une nouvelle aliquote de polymère est poussée dans les capillaires avant chaque analyse, évacuant le polymère de l'analyse précédente. Auparavant, notre laboratoire utilisait le plus long réseau capillaire fourni pour le 3100, de 80 cm de long, et le polymère Applied Biosystems POP-4 pour le milieu de séparation. Cette combinaison a donné environ 900 bases de séquence utile, et les données de seize échantillons ont pu être acquises en 3 heures et 40 minutes avec cette puce et ce polymère. Cependant, nous avons depuis développé des protocoles d'exécution modifiés qui utilisent le dernier polymère d'Applied Biosystems, POP-7, et une matrice de 50 cm. Ce polymère a été développé spécifiquement pour le séquenceur à haut débit d'ABI (le modèle 3730) et s'est avéré fournir des longueurs de lecture plus longues couplées à des temps d'exécution plus courts, mais n'était pas pris en charge pour une utilisation sur le 3100. Avant de passer aux modèles 3130, nous ont pu obtenir, en moyenne, plus de 900-950 bases Phred Q20 avec notre protocole « longue lecture » et 850-900 bases Q20 avec notre protocole « lecture standard » en utilisant nos protocoles modifiés. Le protocole « longue lecture » a une durée d'exécution de 2 heures 45 minutes. Notre protocole de « lecture standard » est terminé en 2 heures, 5 minutes. Certains de ces travaux ont été présentés dans Biotechniques. (2004 juin36(6):932-3). Avec les mises à niveau 3130, nous sommes en mesure d'obtenir des longueurs de lecture et des scores de qualité similaires dans un laps de temps un peu plus court.

L'électrophorèse est facilitée par un circuit électrique haute tension dans le 3130. La charge est conduite à travers le circuit par l'ADN et les ions dans le polymère, les ions dans le tampon utilisé dans l'instrument, et à travers les fils électriques et les électrodes. Le 3130 peut dissiper uniformément et efficacement la chaleur de cette tension en raison de la grande surface des capillaires en silice fondue. C'est cet attribut qui permet d'appliquer une haute tension pendant l'électrophorèse et, par conséquent, contribue à réduire considérablement les temps d'exécution sans perte de résolution. Les séquenceurs plus anciens tels que Applied Biosystems 377, qui utilisaient un gel en plaque pour séparer les fragments d'ADN, ne pouvaient pas non plus dissiper la chaleur et devaient être exécutés considérablement plus lentement et plus longtemps pour atteindre des longueurs de lecture similaires à celles du 3130.

Les fragments de séquençage passent à travers une cellule de détection à l'extrémité de la puce. Les fragments plus courts migrent plus rapidement que les fragments plus longs et traversent la cellule de détection dans cet ordre. Un faisceau laser argon-ion provoque l'excitation des électrons sur les colorants attachés aux fragments d'ADN à un état d'énergie plus élevé. Lorsqu'ils retournent à leur état fondamental, ils deviennent fluorescents. La fluorescence émise est capturée par une caméra à dispositif à couplage de charge (CCD). Cette caméra est composée d'une puce de silice avec des milliers de pixels qui stockent une charge électrique proportionnelle à l'intensité de la fluorescence qui l'atteint. La caméra CCD convertit ensuite les informations de fluorescence en données électroniques qui sont transférées à un ordinateur pour traitement. Le logiciel traite ces données afin de créer un électrophérogramme où chaque pic représente un fragment du produit de séquençage d'ADN.

Quels types d'ADN pouvons-nous séquencer et de quelle quantité avons-nous besoin ?

Le laboratoire de séquençage d'ADN peut séquencer une variété d'échantillons d'ADN, y compris des plasmides, des cosmides, des produits PCR, de l'ADN de phage simple brin et des clones BAC ou PAC. Lorsque vous soumettez de l'ADN pour le séquençage, et si vous fournissez vos propres amorces de séquençage, les concentrations des différents types d'ADN doivent être ajustées comme suit :

type d'ADN Concentration requise Total utilisé dans une réaction
Plasmide 200-250 ng/ul 500-700 ng
Cosmide 200-250 ng/ul 500-700 ng
Produit PCR 10-20 ng/ul 10 ng/100 pb
Phage simple brin 100-150 ng/ul 300 ng
BAC/PAC 300-400 ng/ul 700-900 ng
Votre apprêt personnalisé 1 uM = 1 pmol/uL =

* Veuillez ajuster vos concentrations d'ADN et d'amorces en conséquence pour répondre à nos exigences de concentration.

Aux concentrations énumérées ci-dessus, nous utiliserons environ 3 à 4 ul par réaction. De plus, ces mesures n'ont pas besoin d'être exactement de 200 ng/ul ou 10 ng/ul ou selon ce qui s'applique - ce sont des approximations de combien nous aimerions et si vous êtes un peu en retrait - disons, donnez ou prenez 30 ng/ ul pour les plasmides, 2-3 ng/ul pour les produits PCR - ce sera probablement toujours bien car il existe une gamme de concentrations que nous pouvons utiliser et toujours acquérir de bonnes données de séquence. Et si vos rendements sont bien inférieurs à nos exigences, vous avez plusieurs options. Tout d'abord, si vous avez accès à une centrifugeuse sous vide, aliquotez un volume contenant la quantité TOTALE que nous utiliserions, séchez-le, puis remettez-le en suspension dans l'eau à la concentration souhaitée. Par exemple, si votre concentration initiale d'ADN plasmidique n'est que de 50 ng/ul, prélevez 10-15 ul, séchez-le puis ajoutez 3 ul d'eau. Si vous n'avez pas accès à une centrifugeuse sous vide, notez-le dans le champ commentaires de votre formulaire de demande et nous utiliserons un plus grand volume de votre échantillon dans notre réaction de séquençage de cycle.

Cependant, gardez à l'esprit que le volume maximum d'ADN que nous pouvons ajouter à une réaction de séquençage est de 10 ul, donc afin d'atteindre notre quantité totale minimale d'ADN, votre concentration ne peut pas être bien inférieure à 50 ng/ul pour les plasmides ou les cosmides, 70 -90 ng/ul pour les échantillons BAC et PAC. Si la concentration de votre échantillon est inférieure à cela et que vous n'avez pas accès à une centrifugeuse sous vide, alors faites-le nous savoir et nous pouvons le sécher pour vous dans notre centrifugeuse, ou nous vous montrerons comment le faire. Alternativement, vous pouvez faire une précipitation à l'éthanol et remettre en suspension dans un plus petit volume pour concentrer vos échantillons mais n'oubliez pas d'éliminer toute trace d'éthanol.

Généralement, pour les produits PCR, le rendement du produit n'est pas un problème si vos conditions PCR sont optimisées et robustes. Cependant, si vous avez un grand produit PCR qui doit être séquencé, cela nécessitera plus d'ADN (par exemple, un produit PCR de 2 kb nécessiterait 100-150 ng d'ADN), vous pouvez donc vouloir augmenter votre réaction ou votre pool plusieurs réactions ensemble. De plus, lorsque vous fournissez vos propres amorces personnalisées, veuillez ajuster leur concentration à 1 uM, ou 10 uM pour les échantillons BAC/PAC. A ces concentrations, nous utiliserons 4 ul d'amorce par réaction. Nous fournissons gratuitement un certain nombre d'amorces vectorielles les plus courantes pour le séquençage. Veuillez consulter le lien sur les amorces que nous fournissons pour voir la liste complète. Et dans la mesure du possible, veuillez fournir suffisamment d'ADN et d'amorces pour deux réactions au cas où nous aurions besoin de répéter une réaction pour une raison quelconque.

Choisir sa souche hôte

Le choix de votre souche hôte pour la préparation de votre matrice est une considération importante, car certaines souches produiront un ADN de bien meilleure qualité pour le séquençage automatisé. Certaines souches d'E.Coli peuvent libérer certains facteurs, tels que des endonucléases et de grandes quantités de glucides, au cours de leur lyse qui peuvent être inhibiteurs de la préparation et du séquençage de l'ADN. De plus, certains composants cellulaires, tels que les polysaccharides chargés positivement, peuvent entrer en compétition avec l'ADN pour la liaison dans les méthodes de préparation d'ADN à base de silice qui sont couramment utilisées dans de nombreux kits commerciaux. Il est toujours recommandé de vérifier auprès des fabricants de souches spécifiques pour déterminer s'il existe des difficultés connues qui pourraient survenir lors de l'utilisation de leurs souches avec vos applications. Les souches hôtes qui fournissent généralement des données fiables incluent DH5alpha, DH10B, DH1, C600, XL1-Blue, XL10-Gold, TOP-10 et NM294. XL1 Blue pousse plus lentement que la plupart des variétés et peut entraîner une diminution du rendement en ADN, mais fonctionne généralement toujours bien. Les souches telles que JM101, JM83, HB101, TB1 et TG1 ne sont PAS recommandées car elles peuvent libérer une grande quantité de facteurs inhibiteurs pendant la lyse, ce qui peut conduire à un ADN de mauvaise qualité qui nécessitera des étapes de purification supplémentaires.

D'autres facteurs à considérer lors de la préparation des cultures en croissance sont le choix du support et la sélection des antibiotiques. La prolifération cellulaire doit être évitée car les cellules commencent à se lyser assez rapidement après avoir atteint la phase stationnaire, libérant de grandes quantités d'ADN chromosomique et plasmidique dégradé ainsi que des polysaccharides difficiles à séparer de l'ADN plasmidique. Un milieu LB standard ou un milieu plus riche tamponné est généralement recommandé, car une culture d'une nuit de 10 à 12 heures donnera généralement une densité cellulaire appropriée pour le chargement sur des colonnes ou des membranes, et aura en outre une proportion beaucoup plus faible de matériaux cellulaires dégradés et d'ADN contaminant. . Il est préférable d'éviter les milieux tels que TB ou 2xYT car ils atteindront la phase stationnaire beaucoup plus tôt, et donc une culture d'une nuit donnera une densité cellulaire excessivement élevée ainsi qu'un pourcentage plus élevé de substances inhibitrices. Si vous devez utiliser de tels milieux, il est conseillé de surveiller le temps de culture et le nombre de cellules pour éviter la contamination de l'ADN et la surcharge de la colonne. Une astuce à essayer consiste à laver vos cellules granulées avec du NaCl 0,5 M juste avant la lyse pour aider à éliminer les polysaccharides et les matériaux de support qui peuvent co-éluer avec votre ADN. Remettre en suspension votre culot dans la solution de 0,5 NaCl, bien vortexer et tourner à nouveau, en éliminant le surnageant lorsque vous avez terminé.

La sélection des antibiotiques doit être maintenue tout au long pour éviter la croissance de cellules qui ne contiennent pas de plasmide. En l'absence d'une sélection efficace, les cellules qui ne contiennent pas de plasmide deviendront trop grandes pour les cellules qui en contiennent, ce qui entraînera un faible rendement de l'ADN souhaité. De plus, certains plasmides métabolisent certains antibiotiques, tels que l'ampicilline, pendant la croissance cellulaire, il est donc important de fournir des concentrations appropriées d'antibiotiques pour minimiser l'épuisement. Les antibiotiques doivent être aliquotés et congelés pour maintenir une efficacité optimale.

Préparation et purification du gabarit

La pureté et la concentration de la matrice sont les deux facteurs les plus importants pour obtenir des données de séquence de bonne qualité. La pureté et la concentration de la matrice sont les deux facteurs les plus importants pour obtenir des données de séquence de bonne qualité. Non, ce n'est pas une faute de frappe, c'est juste que nous ne saurions trop insister sur ce principe lorsqu'il s'agit de séquençage fluorescent automatisé, en particulier sur nos 3130 qui nécessitent des méthodes de nettoyage encore plus strictes. Le séquençage fluorescent est très sensible à certains contaminants dans l'échantillon d'ADN et l'ADN qui est considéré comme suffisamment propre pour de nombreuses autres procédures de biologie moléculaire telles que la PCR, le clonage ou même le séquençage radioactif manuel, n'est PAS nécessairement assez propre pour le séquençage fluorescent et peut entraîner une mauvaise des données de qualité ou parfois pas de données du tout. Dans cette section, nous énumérons nos recommandations sur les meilleures façons de nettoyer et de quantifier votre ADN, en fonction du type d'ADN que vous essayez de séquencer.

Les kits Qiagen sont l'une des méthodes les plus universellement acceptées pour fournir un ADN de haute qualité constante pour le séquençage automatisé. Cela ne veut pas dire qu'il n'y a pas d'autres méthodes qui ne fonctionnent pas - nous avons énuméré quelques autres protocoles recommandés - mais d'après notre expérience, les méthodes de nettoyage Qiagen ont simplement le meilleur bilan en termes de fiabilité et de cohérence dans leur produit final.

Une autre option disponible pour la purification de l'ADN qui donne une matrice de haute qualité pour le séquençage automatisé de l'ADN est le kit d'isolement d'ADN mini-plasmide disponible auprès du centre de service de recherche biomédicale (BRSC) de SUNY Buffalo. Ce kit est "une méthode de mini-préparation de lyse alcaline modifiée et rationalisée de Sambrook et al. (Molecular Cloning, CSH, NY) qui élimine le besoin d'un traitement supplémentaire à la RNase et d'une extraction au phénol-chloroforme. L'ADN plasmidique peut être facilement et rapidement purifié à partir de une culture d'une nuit d'E. coli en 15 min avec un rendement typique de 1 à 5 mg d'ADN par ml de culture. L'ADN convient à la digestion de restriction, à la préparation de sondes et à l'analyse PCR. L'ADN à utiliser pour l'analyse de séquençage est soumis à un étape supplémentaire de 5 minutes de précipitation PEG (PS-4) pour éliminer toute trace d'ARN. Des lectures de séquençage d'ADN de haute qualité peuvent être facilement obtenues (près de 1 000 bases résolues par séquence de séquençage) si l'ADN plasmidique est isolé à partir d'un E approprié . coli hôte. Le kit (suffisant pour 300 mini-préparations) est stable pendant au moins un an s'il est manipulé et stocké correctement. (extrait du site web du BRSC). À 95 $ pour 300 minipreps plasmidiques, ce kit est nettement moins cher que les kits Qiagen (environ un quart du coût), rapide et très simple à utiliser. Nous avons vu, de première main, que la qualité de l'ADN obtenu à partir de ce kit est excellente pour le séquençage et nous recommandons l'utilisation de ce kit pour la purification de l'ADN. Le BSRC est une ressource locale de SUNY qui promeut la recherche translationnelle collaborative, développe et commercialise des produits innovants et fabrique des réactifs de recherche de qualité pour la vaste communauté des sciences de la vie. Pour plus d'informations sur le BSRC et ses produits, vous pouvez consulter leur site Web à l'adresse : http://www.acsu.buffalo.edu/

Un lien vers le protocole du kit d'isolement d'ADN mini-plasmide se trouve à l'adresse : Protocole de préparation du mini-plasmide.

Modèles de plasmide

Considérations lors du nettoyage des préparations de plasmides

La mauvaise qualité de la matrice est l'une des raisons les plus courantes des données de séquence incorrectes, comme mentionné ci-dessus, et constitue une considération primordiale lors du choix d'une méthode de nettoyage de plasmide pour donner un ADN d'une pureté optimale pour le séquençage automatisé. La qualité du modèle plasmidique peut être affectée par une variété de facteurs et de contaminants, notamment les suivants :

  • Sels ou matières organiques restants de la préparation du gabarit
  • Présence de composants cellulaires tels que l'ARN, les protéines, les polysaccharides ou l'ADN chromosomique
  • ADN qui s'est dégradé pendant le stockage
  • Fines de silice qui sont transférées des kits de préparation de gabarits qui utilisent des solutions de résine ou de silice en vrac

Voici un tableau des contaminants admissibles et de leurs plages de concentration acceptables qui permettront toujours de bonnes données de séquençage :

Contaminant Quantité tolérée dans la réaction de séquençage
ARN 1 ug
CHEVILLE 0.3%
NaOAc 5-10 mm
Éthanol 1.25%
Phénol 0%
CsCl 5 mm
EDTA 0,25 mm

Certains commentaires sur les effets de certains de ces contaminants sont énumérés ci-dessous :

ARN - Comme vous pouvez le voir à partir de la valeur dans le tableau ci-dessus, une quantité importante d'ARN peut en fait être tolérée dans la réaction de séquençage. C'est un contaminant courant dans les minipreps plasmidiques, en particulier lorsque les colonnes sont surchargées et que la capacité des tampons de lyse est dépassée - la surcharge peut être un problème avec les minipreps Qiagen. L'une des façons dont l'ARN peut potentiellement interférer est lors de la quantification de vos préparations d'ADN par spectrophotomètre - l'ARN absorbe également à 260 et lorsqu'il y en a une grande quantité, il peut vraiment nuire à la précision de votre concentration. Il est donc préférable de traiter vos préparations de modèles avec de la RNase ou une précipitation saline élevée et également de quantifier vos échantillons à la fois par gel et par spectroscopie.

CHEVILLE- la présence de polyéthylène glycol résiduel dans la préparation de la matrice peut avoir un effet inhibiteur sur le cycle de séquençage de l'enzyme Taq polymérase et conduire à un signal faible.

Sels- la processivité de la Taq polymérase utilisée dans la réaction de séquençage cyclique diminue en présence de quantités élevées de sels. La contamination par le sel dans les préparations d'ADN peut résulter d'une coprécipitation de sels dans des précipitations à l'alcool, d'une élimination insuffisante du surnageant après les précipitations ou d'un lavage incomplet du culot avec de l'éthanol à 70 %. Une technique prudente doit être utilisée lors de la précipitation avec de l'alcool. Il a également été démontré que les ions acétate, par opposition aux ions sodium, potassium ou chlorure, sont les plus inhibiteurs dans les réactions de séquençage. Lors de l'utilisation d'acétate de potassium ou d'acétate de sodium, des concentrations supérieures à 20 mM ont conduit à un échec complet des réactions de séquençage, tandis que des concentrations de 60 mM de chlorure de sodium étaient nécessaires avant une inhibition complète. Les sels peuvent être inhibiteurs lorsque nous séquençons des échantillons sur notre 377 à base de gel, mais sont encore plus problématiques lors de l'analyse d'échantillons sur notre système capillaire 3100, car ces sels plus petits et chargés sont préférentiellement injectés et interfèrent avec la migration des échantillons d'ADN.

Éthanol- une contamination par l'éthanol peut se produire lorsque l'échantillon est insuffisamment séché après précipitation ou lorsqu'il est transporté dans un tampon de lavage contenant de l'éthanol utilisé dans certaines procédures d'isolement d'ADN. Une contamination avec des concentrations d'éthanol de 10 % ou plus entraîne généralement l'échec de la réaction de séquençage de l'ADN. Un séchage complet des échantillons d'ADN est nécessaire pour éliminer ces traces d'éthanol.

Phénol- le phénol peut être transféré des méthodes de lyse alcaline de l'ADN qui utilisent le phénol et le chloroforme pour éliminer les protéines et autres contaminants cellulaires des lysats cellulaires. Le phénol ne peut pas être toléré dans la réaction de séquençage cyclique car il dénature les protéines et dégradera ainsi l'enzyme polymérase Taq utilisée dans la réaction de séquençage cyclique. Le chloroforme n'a pas les fortes propriétés dénaturantes du phénol et ne semble pas nuire à la réaction de séquençage.

Chlorure de césium - En utilisant un protocole de gradient de densité d'ultracentrifugation au chlorure de césium, on peut obtenir un ADN de très haute qualité adapté au séquençage automatisé. CEPENDANT, il est fortement recommandé d'effectuer soit une dialyse suivie d'une précipitation à l'éthanol (meilleure méthode), soit une précipitation minimale à l'isopropanol à température ambiante pour éliminer toute trace de chlorure de césium résiduel car le césium peut inhiber la Taq polymérase utilisée dans le cycle de réaction de séquençage.

EDTA - L'EDTA peut chélater le magnésium requis par la Taq polymérase dans la réaction de séquençage du cycle. Par conséquent, lors de la soumission des échantillons, il est préférable de toujours les diluer ou de les remettre en suspension dans du tampon stérile ddH20 ou 1X Tris. La suspension dans le tampon TE n'est pas recommandée, bien que des gens l'aient fait et souvent, il n'y a pas de problème. Cependant, fournir de l'ADN matrice dans l'eau est une chose facile à faire et s'il y a un problème avec la qualité de votre séquence, le fait qu'il n'y a pas d'EDTA dans votre échantillon est un problème potentiel que nous pouvons éliminer immédiatement.

Principes du kit Qiagen

Comme mentionné ci-dessus, Qiagen fabrique des kits pour extraire et purifier tous les types d'ADN, y compris l'ADN plasmidique. Les kits de minipréparation de plasmides Qiagen contiennent une résine échangeuse d'anions constituée de groupes DEAE chargés positivement qui se lient de préférence au squelette d'ADN chargé négativement. Une fois que l'ADN est lié à la résine, d'autres contaminants tels que les sels, les protéines, l'ARN et les glucides sont éliminés par lavage dans un tampon à faible teneur en sel. L'ADN est élué dans une deuxième étape, en utilisant un tampon à haute teneur en sel pour le dissocier de la résine. Ce kit est conçu pour donner l'ADN de la plus haute pureté et est un peu plus coûteux. Un autre kit proposé par Qiagen est le kit Qiaprep qui utilise une membrane à base de gel de silice pour lier l'ADN en présence de fortes concentrations de sels chaotropiques. Les sels sont éliminés avec un lavage à l'éthanol et l'ADN est ensuite élué avec un tampon Tris de faible force ionique. Cette méthode se présente sous la forme d'une colonne de centrifugation qui peut être utilisée soit dans une centrifugeuse, soit sur un collecteur à vide. Ce kit donne de l'ADN d'une pureté adaptée au séquençage et est également moins cher. Cependant, il faut garder à l'esprit certains facteurs lors de l'utilisation des kits Qiagen ou de tout autre kit de miniprep basé sur des colonnes. Premièrement, ne surchargez pas les colonnes - l'ARN et les polysaccharides peuvent entrer en compétition avec l'ADN pour se lier à la résine de la colonne et conduire à de faibles rendements de l'ADN plasmidique souhaité. Suivez les instructions pour la croissance cellulaire et utilisez les médias LB comme recommandé. Deuxièmement, n'oubliez pas de laver l'ADN avec de l'éthanol à 70 % après la précipitation à l'isopropanol afin d'éliminer les sels en excès. Le lavage deux à quatre fois avec de l'éthanol peut améliorer la qualité de l'ADN et, en outre, des lavages supplémentaires avec la solution de liaison peuvent aider à éliminer d'autres contaminants. Troisièmement, le réchauffement de votre tampon d'élution peut aider à améliorer le rendement. Et enfin, éliminer toute trace d'éthanol avant de remettre en suspension le produit final dans l'eau.

Méthodes de lyse alcaline/PEG

Les bactéries peuvent être lysées pour libérer l'ADN plasmidique par un certain nombre de méthodes, notamment le traitement avec des détergents, des solvants organiques, la chaleur ou un alcali. Lorsque vous essayez d'isoler de gros plasmides (>15kb) qui sont plus susceptibles d'être endommagés pendant la procédure de lyse, une méthode plus douce, telle que la centrifugation à l'équilibre ou la lyse impliquant un détergent comme le SDS, doit être utilisée. Lors de la lyse des cellules pour récolter des plasmides plus petits, des méthodes plus puissantes, telles que le traitement alcalin, peuvent être utilisées. Ces traitements provoquent la dénaturation et la dégradation de l'ADN chromosomique linéaire de l'hôte. Les brins d'ADN plasmidique circulaires fermés ne se séparent pas complètement car ils sont topologiquement entrelacés et lorsque les conditions sont revenues à la normale, les brins se réhybrident précisément dans la conformation native en tant que molécules superhélicoïdales.

Les protocoles de lyse alcaline standard, lorsqu'ils sont couplés à une précipitation au PEG, peuvent conduire à un petit ADN plasmidique d'une pureté suffisante pour une utilisation dans le séquençage fluorescent automatisé. Ce qui suit est un protocole détaillé pour le traitement par lyse alcaline/PEG qui est recommandé par Applied Biosystems, les fabricants de nos séquenceurs d'ADN.

Remarque : pour minimiser le cisaillement de l'ADN chromosomique contaminant, n'utilisez pas de vortex pendant cette procédure.

  1. Pellet 1,5 -4,5 ml d'aliquotes de culture pendant 1 minute dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale.
  2. Retirer le surnageant par aspiration.
  3. Remettre en suspension le culot bactérien dans 200 ul de tampon GET en pipetant de haut en bas.
  4. Ajouter 300 ul de NaOH 0,2 N/1% SDS fraîchement préparé. Mélanger le contenu du tube par retournement. Incuber sur glace pendant 5 minutes.
  5. Neutraliser la solution en ajoutant 300 ul d'acétate de potassium 3,0 M, pH 4,8. Mélanger en retournant le tube. Incuber sur glace pendant 5 minutes.
  6. Retirez les débris cellulaires en tournant dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10 minutes à température ambiante. Transférer le surnageant dans un tube propre.
  7. Ajouter RNase A (DNase free) à une concentration finale de 20 ug/ml. Incuber le tube à 37C pendant 20 minutes.
  8. Extraire deux fois le surnageant au chloroforme :
    1. ajouter 400 ul de chloroforme
    2. mélanger les couches par inversion pendant 30 secondes
    3. centrifuger le tube pendant 1 minute pour séparer les phases
    4. transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube propre.

    Purification du chlorure de césium

    La purification de l'ADN plasmidique à l'aide d'une méthode de gradient de densité telle que la centrifugation à l'équilibre dans des gradients de bromure de CsCl-éthidium peut produire un ADN ultrapur et est particulièrement utile pour purifier de gros plasmides ou de petits plasmides qui doivent être utilisés dans des expériences plus rigoureuses, telles que des mesures biophysiques. Ce protocole tire parti du fait que le bromure d'éthidium s'intercalera en différentes quantités lorsqu'il rencontrera des molécules d'ADN circulaires linéaires ou fermées. En raison de la liaison différentielle de ce colorant, les densités de flottabilité de l'ADN circulaire linéaire et fermé qui se forment après la centrifugation seront différentes dans les gradients de CsCl contenant des quantités saturantes de bromure d'éthidium, permettant ainsi une séparation efficace de l'ADN plasmidique de l'ADN chromosomique contaminant, entaillé ADN plasmidique circulaire, ARN et protéines. Cette méthode a longtemps été l'étalon-or pour obtenir de l'ADN très pur, mais elle est assez longue et coûteuse. Des kits commerciaux ou des méthodes de lyse alcaline modifiées fournissent un ADN de qualité adéquate pour le séquençage automatisé, et éliminent ainsi le besoin d'une méthode aussi stricte. Cependant, si la purification au chlorure de césium est votre méthode de choix, les protocoles peuvent être trouvés dans les manuels Maniatis Molecular Cloning.

    Quelques notes finales sur les purifications de plasmides

    Les méthodes d'extraction d'ADN par ébullition ne sont pas acceptables pour le séquençage automatisé, à moins qu'elles ne soient extraites au phénol/chloroforme pour éliminer toutes les protéines. Les endonucléases ne sont pas toujours complètement inactivées pendant la procédure d'ébullition et l'ADN plasmidique peut être dégradé en présence de Mg++ dans les procédures d'incubation ultérieures.

    Et si, au final, votre préparation de plasmide n'est toujours pas d'une pureté optimale pour de bonnes données de séquence de nos séquenceurs, voici quelques recommandations pour d'autres étapes de nettoyage qui peuvent aider :

    • Purifiez votre ADN par ultrafiltration, en utilisant les colonnes Centricon-100 Micro-concentrator. Voir le protocole dans les colonnes Ultrafiltration/Seuil de poids moléculaire.
    • Purifier par extraction supplémentaire :
      1. Extraire l'ADN deux fois avec 1 volume de chloroforme ou chloroforme:alcool isoamylique (24:1 v/v)
      2. Ajouter 0,16 volume de NaCl 5M et 1 volume total de PEG 13%.
      3. Incuber sur glace pendant 20 minutes, puis centrifuger à vitesse maximale dans une microcentrifugeuse à 2-6C pendant 20 minutes.
      4. Rincer le culot deux fois avec de l'éthanol à 70 %.
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.
    • Purify using minimal isopropanol precipitations:
      1. Add 0.5 volume of 7.5M ammonium acetate or 0.1 volume of 3M sodium acetate to a dilute DNA solution (<100 ng/ul) and mix well.
      2. To this total volume, add 0.6 volume of room temperature isopropanol and mix well.
      3. Incubate at room temperature for 5 minutes, then centrifuge at maximum speed to pellet the DNA.
      4. Fill tube with 70% ethanol and do a complete wash of the pellet.
      5. Dry the pellet in a vacuum centrifuge for 3-5 minutes or to dryness.

    PCR products

    Considerations when cleaning up PCR products

    When submitting PCR products for direct sequencing, it is essential to separate the PCR product away from potentially interfering substances that may remain in solution after the PCR reaction. These contaminants can sometimes participate, and thus interfere, in the cycle sequencing reaction and lead to poor quality data or no data at all. Most importantly, primers and dNTPS should be removed. If both forward and reverse PCR primers remain in solution, they will both act as sequencing primers, resulting in multiple peaks from beginning to end as each primer can anneal to complementary strands with different nucleotide composition, and thus lead to overlapping fragments and unreadable data. Excess dNTPs should also be removed as they will upset the specific ratios of dNTPs/ddNTPs required for optimal extension and termination in the cycle sequencing reaction.

    Another consideration when choosing your PCR cleanup method is the determination of the presence of a single band or multiple bands that may result from your PCR reaction. Once the PCR reaction is completed, you should run a small aliquot on an agarose gel to assess its quality. If you have a single specific band, then it will be sufficient to remove excess PCR reactants using one of the methods listed below. If your PCR reaction generates multiple bands, an excessive amount of primer-dimers, or low-intensity smearing, it will then be necessary to run your PCR product out on a gel, excise your band of interest, and purify it away from the gel. Alternatively, you may want to spend some time optimizing your PCR reaction to eliminate the presence of these additional bands or artifacts and thus save yourself some downstream time in gel purifying your PCR products for sequencing.

    Regardless of which purification method you choose, you should always quantitate your PCR product after purification as no cleanup method will give 100% recovery. Any quantitative estimates you make when initially running your PCR product out on an analytical gel will be inaccurate as you will inevitably lose some product during purification, especially when gel purifying.

    Single PCR band

    Qiaquick PCR purification kit

    Qiagen makes PCR purification kits that come in either a microcentrifuge or vacuum manifold format, and can process anywhere from one PCR product using spin columns up to 96 samples in a 96 well plate. Fragments ranging in size from 100 bp up to 10 kb can be purified away from primers, dNTPs and salts that can interfere in the sequencing reaction. The protocol is simple and involves binding of DNA to the column or well membrane, washing away of contaminants, and elution of the DNA from the membrane. One nice thing about this kit is there are no extra steps to remove any mineral oil that may be present in the PCR solution.

    Exonuclease I/Shrimp Alkaline Phosphatase

    ExoSAP-IT is a product manufactured by USB Corporation and is an excellent method for purifying PCR reactions that produce one specific band. The Exonuclease I component functions to hydrolyze any residual single-stranded primers and any single-stranded DNA fragments produced in the PCR reaction. The Shrimp Alkaline Phosphatase degrades any excess dNTPS remaining in the reaction. The ExoSAP mixture is added directly to the PCR reaction, incubated at 37ºC for 15 minutes for hydrolysis of single-stranded DNA and dNTPS, and then incubated at 80ºC for 15 minutes to inactivate the enzymes.

    Ultrafiltration/Molecular weight cutoff columns

    Amicon Microcon and Centricon devices, which can be purchased from Millipore, are available with 30,000 and 100,000 molecular weight cut-off [MWCO] membranes and can separate primers from the synthesized PCR product. When purifying smaller PCR products (170 bp or less), choose the Centricon 30. For larger PCR products, the Centricon 100 works well. They will concentrate and desalt the DNA simultaneously, typically removing over 90% of the non-incorporated primers and dNTPs. When using either device, a small sample cup, or reservoir, is fitted into a collection tube. The reservoir contains the size-exclusion membrane at its bottom surface. The PCR product is loaded into the sample reservoir along with a suitable volume of distilled water (400 ul when using the Microcon filter, 2 ml for the Centricon), and then spun in a centrifuge. Salts, dNTPs and primers are spun through into the collection tube. To recover purified DNA, remove the sample reservoir from the vial, invert into a new tube and spin once again. The clean PCR product will then be captured in the second collection vial. Due to the increased wash volume and concentration factor, one spin in a Centricon device removes >95% of a 25 bp primer. A second spin removes up to an additional 4%. The Microcon filter will benefit from additional washes - one wash removes approximately 87% of primers, while three washes will filter away between 95%-99% of standard PCR-size primers.

    Ethanol precipitation

    If performed carefully, ethanol precipitation will yield PCR products of adequate purity for direct sequencing. However, if not done properly, residual primers and dNTPS, as well as any remaining ethanol, will give poor sequence data so be sure to remove supernatant carefully and completely, and keep your eye on the pellet.

    Both protocols listed below are for 50 ul PCR reactions, which tend to give better yields after purification, especially for larger products. For PCR reactions greater than 50 ul, proportionally scale up the reagents listed. For reactions less than 50 ul, add water to bring the volume to 50 ul. If mineral oil is present in the PCR reaction, add 100 ul of chloroform, (do not mix with PCR solution), spin at 10,000 RPM for 30 seconds and then aspirate supernatant into a clean tube. The chloroform/mineral oil component will settle to the bottom.

    • Protocol 1
      Thoroughly mix 25ul of 7.5M ammonium acetate with 190 ul 95% ethanol. Add purified supernatant (if mineral oil was previously used) or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Centrifuge at 10,000 RPM for 10 minutes at 4ºC. Completely remove supernatant, and dry the pellet, either by air-drying or in a vacuum centrifuge (do not overdry, a few minutes in a vacuum centrifuge will be fine). Resuspend in 20 ul of water.
    • Protocol 2
      Thoroughly mix 5 uL of 3M sodium acetate, pH 4.6, with 100 uL of 95% ethanol. Add purified supernatant or your PCR solution to this mixture. Vortex and place on ice, or at -20ºC, for 30 minutes to precipitate PCR products. Spin tubes in a microcentrifuge at maximum speed for 20 minutes. Completely remove supernatant and discard. Add 300 ul of 70% ethanol to rinse the pellet, vortex briefly, and spin for an additional 5 minutes at maximum speed. Completely remove supernatant and discard, being careful not to lose the pellet. Dry the pellet and resuspend in 50 ul water.

    Multiple PCR bands

    Gel purification

    When purifying a PCR product by gel filtration, either standard or low melting point agarose with TBE or TAE buffer may be used. However, it is important to use a high quality agarose such as FMC SeaPlaque or SeaPrep to minimize carryover of unwanted contaminants that may inhibit the sequencing reaction. When purifying the PCR band, the gel containing the PCR product of interest is first visualized under a UV light source and the band is then excised out of the agarose gel with a clean, sharp razor - minimize the amount of agarose that is cut out with the band, even if it means losing a bit of DNA. Tiny bits of agarose can have an adverse affect in the sequencing reaction. In addition, it is important to remember that UV light is damaging to your DNA - damage can occur in the time it takes you to cut out your band and it’s effect can become apparent when sequencing your DNA as you may see dramatically shortened read lengths. So whenever possible, reduce the intensity of the UV light source, reduce your exposure times or use a 366 nm UV source if available. Placing a glass plate between the light source and your gel can also help lessen the degrading effect of the UV light on your DNA. Once your band of interest has been isolated from the gel, numerous methods can be used to separate the PCR product away from the agarose slice, including the Qiaquick Gel Purification kit (MOST HIGHLY recommended), Millipore Ultrafree kit with modified TAE buffer, Promega PCR Wizard preps and Bio101 Geneclean kits. Follow the manufacturer’s direction carefully.

    PCR products should be examined and quantitated on an agarose gel AFTER gel purification as well, as you will not get 100% recovery and your assumed PCR concentration for sequencing will not be accurate.

    BAC/PAC DNA

    Considerations when cleaning up BAC/PAC DNA

    When attempting to sequence large DNA templates such as bacterial artificial chromosomes (BACs) or P1 derived artificial chromosomes (PACs), the quality of DNA template becomes even more crucial. As with plasmid DNA purification, Qiagen kits give excellent results for purification of BAC DNA for sequencing and they provide a few different methods for cleaning up the template DNA, including Qiafilter cartridges and a Large-Construct kit, the latter being somewhat more involved. One modified protocol of the Qiafilter Plasmid Midi Kit, which has consistently given good quality BAC DNA for sequencing, has been kindly provided to us from Wenjie Wu and we will post his modifications here.

    • use 100 ml of BAC culture
    • P1 buffer: add 10 ml
    • P2 buffer: add 10 ml
    • P3 buffer: add 10 ml
    • after addition of P3 buffer, incubate the sample on ice for 15 min, then centrifuge at 4000 rpm for 30 minutes at 4ºC (no incubation at room temperature).
    • add the supernatant from the centrifuged sample to the cartridge and filter the samples into a clean tube
    • apply the filtered supernatant to the Qiagen-tip for further purification and follow remaining Qiagen protocol.
    • when eluting the DNA, first warm the QF solution to 65ºC and elute 5 x 1ml to maximize yield.

    Other BAC purification methods can be used, including CsCl purification, and some other protocols are available at the following websites:

    University of Oklahoma Advanced Center for Genome Technology:
    http://www.genome.ou.edu/DblAcetateProcV3.html

    Note: BAC DNA prepped on the Autogen instrument generally does not work well for sequencing

    Methods for Quantitation

    There are three methods commonly used for quantitating DNA - spectrophotometry, agarose gel analysis and fluorometry. These methods can also give you a sense of how clean your DNA is, although none of these methods will detect everything. When using the spectrophotometer, you will typically take readings at both A260 and A280, as DNA will absorb at A260 while protein absorbs at A280. These readings will give you an A260/A280 ratio. A good DNA A260/A280 ratio should be between 1.7-1.9. If you find your ratio is smaller, this could indicate contamination of your sample with proteins or organic chemicals. If possible, use a spectrophotometer that is capable of performing a wavelength scan from 220 nm to 330 nm as a scan may be useful in revealing other contaminants such as phenol, which is detectable at 230nm, and particulates in solution that may absorb at 325nm. When calculating your DNA concentration with a spectrophotometer, you will need to know that one A260 O.D. unit (absorbance) of double-stranded DNA contains 50 ng/ul. One O.D. unit is the amount of a substance dissolved in 1 ml that gives an absorbance reading of 1.0 in a spectrophotometer with a 1-cm path length. So to calculate the concentration of DNA you have you will multiply the absorbance value times the conversion factor of 50ng/ul times any dilution factor you may have used and this will give you the concentration of your sample in ng/ul or mg/ml. However, quantitation of your DNA by spec is probably the least accurate of the three methods as both RNA and contaminating DNA will also absorb at 260nm and can potentially lead to inaccurate values. Also, readings greater than 1.0 OD or less than 0.05 are probably not very accurate, limiting the sensitivity and range of this method.

    Quantitating by agarose gel electrophoresis tends to be more accurate as you can visualize any contaminating DNA or RNA. Purified DNA should run as a single band on an agarose gel, while uncut plasmid DNA will show three bands: supercoiled, nicked and linear. This method is also useful when quantitating small amounts of DNA such as PCR products. The DNA sample is run on a gel next to a mass ladder composed of fragments of known and varying concentrations and the intensity of your DNA band is visually compared to the intensities of the bands from the mass ladder to estimate DNA concentration. When using an agarose gel, you can’t detect the presence of proteins or chemicals. To get the most information about the amount and quality of your desired DNA, both spectroscopic and gel quantitation methods should be used together.

    Perhaps the most accurate method of measurement of the three is the use of a fluorometer. Dyes may be added to the DNA such as Hoechst 33258 Dye or Picogreen which intercalate into AT rich regions of double stranded DNA and are thus quite specific to double stranded DNA, avoiding the problems of contaminating RNA seen when using a spectrophotometer. Common contaminants present in DNA preparations such as salts, urea, ethanol, chloroform, detergents, proteins and agarose do not have significant affect on these assays and thus lead to a much more sensitive and precise method for quanititation. Fluorometric measurements can detect DNA levels as low as 5 ng/ul.

    Primer design

    There are many programs on the Internet that can help you choose primers, determine potential primer-dimer formation or hairpin structures, and calculate Tm. These programs can be especially helpful when you need to design multiple sets of primers to ensure coverage of a large region of DNA. Look at our section Useful Links for some primer design programs that we have found helpful. That being said, here are some common rules for sequencing primer design:

    • primer should be 18-24 nucleotides in length - this helps ensure good and specific hybridization to the template DNA. Long primers (>35-40bp) tend not to work quite as well in sequencing due to the increased chances of secondary structure formation
    • G/C content should be approximately 50%, but the range can be 30-80%
    • Tm should be between 50º-60ºC - if your Tm is much below that it may not hybridize properly, as the annealing temperature in our cycle sequencing reaction is 50ºC. If necessary, add a few more bases to your primer to increase its Tm. To calculate the Tm of your primer use the following formula:
      • Tm = 4(G + C) + 2(A + T)º C

      As a last note on ordering primers - while purity of a primer is important, it is generally not necessary to have ultrapure primers, such as those purified by HPLC or OPC cartridge, though that is, of course, optimal. As long as the oligo synthesis efficiency was high and the majority of your primer solution contains full-length primers, then simple desalting of your primers should be fine. Primers of poor synthesis quality will not work well for sequencing because, along with your full-length product, there will be a greater proportion of "failure" primers (i.e. truncated primers of less than full length, in varying sizes) that can also act as sequencing primers. Sequence data from these primers will be poor, ranging from unusable to minor "shadow" peaks under the proper peaks. See more in our Troubleshooting section to see how to recognize this problem. When submitting custom primers for sequencing, dilute them in water to the proper concentration.

      For the do-it-yourselfers

      For those selecting the economical choice of setting up your own sequencing reactions, certain things must be taken into consideration. First, you will need to purchase the kit to perform your cycle sequencing reactions. Cycle sequencing is the method required to amplify and fluorescently label your DNA so that it can be detected on our automated sequencers. Cycle sequencing is very similar to PCR, but with two major differences. In cycle sequencing, one primer is used instead of two, thus giving linear amplification of one labeled strand. In addition, a mixture of labeled and unlabeled dNTPs are used in the reaction mix to allow for fluorescent labeling of the DNA and fragment chain termination. Read our Principles of automated fluorescent DNA sequencing section for more detailed information on the basics of cycle sequencing. Once the reactions have been set up, you will need to run them in a thermal cycler to effect the incorporation of fluorescently labeled ddNTPs and amplification of your desired DNA. Once the cycle sequencing reaction is completed, you will need to purify the reaction to remove salts, unused reactants and, most importantly, unincorporated Dye Terminator molecules. If this step is not performed carefully, these excess dye molecules will migrate along with your DNA and cause what are known as “dye blobs” which can interfere with proper basecalling of your DNA. See out Troubleshooting section for an example of a dye blob.

      With that being said, we’ve provided below our recommendations and protocols, as well as a listing of some supplies and part numbers you’ll need to get started.

      Réactifs

      Cycle sequencing reaction mixes must be purchased from Applied Biosystems, manufacturers of our sequencers. For best sequence quality and read length, we recommend the use of Big Dye Terminator chemistries, which is what we use in our sequencing reactions. Two standard chemistries are available for routine template sequencing, Big Dye Terminator v3.1 and 1.1. Part numbers are listed below:

      BigDye ® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit
      (protocol ordered separately p/n 4337035)


      Illumina DNA PCR-Free Support

      Generate end-to-end documentation tailored to your experiment.

      Library Prep and Array Kit Selector

      Determine the best kit for your project type, starting material, and method or application.

      Sequencing Coverage Calculator

      Determine reagents and sequencing runs for your desired coverage.

      Entraînement

      Maximize the effectiveness of your Illumina system, train new employees, or learn the latest techniques and best practices. We offer support webinars, online courses, expert video tips, and instructor-led trainings.

      Featured Training

      Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation

      Overview of the Illumina DNA PCR-Free Prep, Tagmentation kit and the various steps in the library preparation protocol.

      Sequencing: Fundamentals

      After completing this course you will be able to describe DNA, RNA and the central dogma discuss traditional sequencing methodologies and compare traditional sequencing to sequencing by synthesis.

      Preventing Contamination

      Best practices for minimizing PCR contamination when amplifying DNA.

      Online Community
      Join the Conversation

      The Community at Illumina can help you connect with peers and industry experts, share best practices, exchange tips and tricks, and get the support you need in easy-to-use online forums.

      MyIllumina
      Lab Management Made Simple

      Insight into your entire relationship with Illumina, at a glance. Keep up with instrument runs, product orders, support inquiries, and more through a personalized dashboard.

      Contact Us
      Technical Support
      Share With Tech Support

      Get instructions for sharing your desktop while working with Technical Support.

      Other Support
      Contact Us
      Technical Support
      [email protected]
      Other Support

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      Potential Beyond Drug Discovery

      Such next-generation sequencing approaches are used by pharmaceutical companies such as Novartis, as well as many academic centers, some of them involved in cancer genome sequencing consortiums, to generate lists of genes that are frequently mutated in certain cancer types, explains Barretina. “Once you are armed with that knowledge, you can start designing drugs that will actually target those genetic alterations in particular cancers.”

      As soon as a patient is diagnosed, we should quickly determine what’s driving the cancer and use that information to select an appropriate therapy.

      Wendy Winckler, Executive Director of Next-Generation Diagnostics at Novartis Institutes for BioMedical Research

      Cataloging genetic alterations of cancer cells was one of the principal goals behind the Cancer Cell Line Encyclopedia — a massive undertaking and collaborative project between Novartis and the Broad Institute, also based in Cambridge, Mass. The encyclopedia provides genetic information on approximately 1,000 different cancer cell lines originally derived from patients’ tumors. The data is released publicly so that researchers around the world can mine it. Cell lines are easy-to-use cancer models that allow researchers to investigate cancer biology and test the effectiveness of potential drugs against various types of tumors. The Cancer Cell Line Encyclopedia also contains corresponding data detailing which cell lines respond to which drugs.

      Giordano Caponigro, one of the leaders of the Cancer Cell Line Encyclopedia collaboration, is now senior director in Oncology Translational Research at Novartis. He explains how next-generation sequencing is increasing the value of this resource. “When the Cancer Cell Line Encyclopedia started, next-generation sequencing hadn’t really hit its stride, but as it went on we realized this was an important technology,” he says. “Shortly, whole-genome sequencing of the full set of cancer cell lines will be complete, which will help with the development of highly accurate diagnostic tools and effective new cancer treatments.”


      Possibilités d'accès

      Obtenez un accès complet au journal pendant 1 an

      Tous les prix sont des prix NET.
      La TVA sera ajoutée plus tard dans la caisse.
      Le calcul des taxes sera finalisé lors du paiement.

      Obtenez un accès limité ou complet aux articles sur ReadCube.

      Tous les prix sont des prix NET.


      V-pipe has a modular and extensible architecture. Users can design their own fully reproducible and transparent pipelines. Developers can test their own tools in a defined environment and contribute to the establishment of best practices for virus research and clinical diagnostics.

      V-pipe is freely available for download from GitHub. Further details on how to run the pipeline, as well as a test dataset, can be found on the dedicated Wiki pages of the repository, accessible through the V-pipe website’s Usage tab.

      Should you have any further question, please do not hesitate to contact us.


      New Approach to Nanopore Sequencing That Is Sure to CATCH Your Interest

      A group of scientists from Tel Aviv University recently performed an experiment utilizing Cas9-Assisted Targeting of CHromosome segments (CATCH) to isolate a gene typically associated with breast cancer, BRCA1, and used nanopore sequencing to map the gene.

      Experimental Fulcrum

      The team extracted 200kb strands of DNA from primary human peripheral blood cells—containing the 80kb BRCA1 gene and its adjacent sectors—and proceeded to process the strands with long-range amplification. Once the target sequence of 200kb was sufficiently enriched, the team began nanopore sequencing which allowed them to determine the order of nucleotides that comprised the section of interest, and even allowed for the registration of both coding and non-coding areas which may help shed light on less straightforward genetic determinants.

      Being able to extract, amplify, and analyze only 200kb rapidly expedites the ability to sequence a specific area within the human genome as compared to the massive 3 billion base pairs that make up all of our genetic information. “Due to high sequencing costs, cutting out only the region of interest from the genome focuses all your sequencing efforts and money toward this target without ‘wasting’ reads on DNA from the rest of the genome,” explains Yuval Ebenstein, Ph.D., a professor at Tel Aviv University.

      Techniques for mapping the genome are varied, including single-molecule real-time (SMRT) sequencing, nanopore sequencing, and, a little older but still relevant attributable to its higher accuracy, next-generation sequencing (NGS)—an umbrella term for technologies such as Illumina sequencing.

      However, while these methods have proven effective they are not without their limitations. NGS is hindered due to its inability to process structural aberrations greater in size than a few hundred base pairs. Long-read methods such as SMRT and nanopore sequencing are capable of detecting variations that NGS can’t, and both provide real-time viewing of data. Nanopore sequencing takes it a step further and is capable of analyzing native DNA without the need for PCR amplification techniques—which all other sequencing methods depend on. The elimination of prerequisite amplification is a huge advantage because it is often during PCR amplification that more errors and single nucleotide polymorphisms (SNPs) are produced. With that said, nanopore sequencing still has a ways to go in terms of achieving greater accuracy, while NGS has shown itself to be tried and true.

      Dr. Ebenstein points out that while nanopore sequencing is normally able to make use of native DNA, “CATCH isolates only a tiny fraction of the genome which means that very low amounts of DNA are recovered for library preparation. Currently, this implies that the DNA must either be isolated from a very large amount of cells or amplified to achieve the needed amount of material for sequencing.”


      CATCH nanopore sequencing promises to increase our genome mapping capabilities. [Tel Aviv University]

      Finance, Function, and Future

      Qu'est-ce que tout cela veut dire? NGS is incapable of processing reads bigger than a few hundred base pairs, while nanopore technology is capable of processing reads up to several kilo base pairs. However, an intrinsic obstacle to nanopore sequencing is that it can be expensive. It’s true that the upfront cost for Oxford Nanopore Technologies’ MinION retails for only $1,000, but while “the initial capital investment is indeed lower, the price per base on the MinION is still considerably higher than NGS,” notes Dr. Ebenstein, “although [nanopore sequencing] can obtain information that is inaccessible to NGS.”

      By utilizing CATCH, scientists can isolate and enrich smaller portions of the genome, as done in this experiment, by having the Cas9 cut at the sequence of interest’s flanking regions. It is possible to expedite the process, as nanopore sequencing can be used only on the cut-out region of interest rather than the entire genome. That was one of the crucial points that the team wanted to convey with this experiment.

      “CATCH brings nanopore sequencing closer to the clinic by offering targeted, cost-effective sequencing,” explains Dr. Ebenstein. “You only need sequence knowledge for two regions flanking your target, thus enabling the enrichment of large variable regions in the genome that are very complex and challenging for conventional approaches.”

      This is cause for excitement as CATCH furthers the potential of an already impressive technique for DNA sequencing. Nanopore sequencing is already highly valued for its ultra-long reads and real-time analysis capability, but with the incorporation of CATCH the entire process can occur even faster and with greater fiscal efficacy.

      “The long reads provided by nanopore sequencing allow for the characterization of structural variations in conjunction with smaller aberrations such as SNPs. Together, this information is critical for understanding the genetic causes of disease,” states Dr. Ebenstein.

      The results of the experiment were telling as to the capabilities and limitations of both NGS and nanopore sequencing. In their paper, published in Recherche sur les acides nucléiques as “Selective nanopore sequencing of human BRCA1 by Cas9-assisted targeting of chromosome segments (CATCH)”, the team shared data that “NGS discovered 177 SNPs. Nanopore data revealed 62% of the SNPs with only two SNPs not present at all in the nanopore data and the remaining 37% inconclusive.”

      “NGS has a lower error rate compared to nanopore. Therefore, it is more qualified to detect single base mutations,” says Dr. Ebenstein. “On the other hand, sufficient coverage (offered by CATCH) can overcome these errors by averaging over many reads. In addition, nanopore has better access to larger aberrations such as structural and copy number variants.”

      Yael Michaeli, Ph.D., School of Chemistry, Faculty of Exact Sciences at Tel Aviv University, mentions that their team “used a software that is more compatible with NGS reads and this in part may explain the inferior results of the nanopore.”

      It’s clear that there are still some areas of uncertainty surrounding nanopore sequencing and compared to the competition it still has to prove itself a little further in terms of reliability. Still, Dr. Ebenstein believes that “by now it seems quite clear that nanopore sequencing will find its place in routine genomic analysis pipelines. [However,] it is still more expensive than NGS, and should be chosen only when needed.”


      Next-Generation Sequencing (NGS)

      Next-generation sequencing (NGS) is a massively parallel sequencing technology that offers ultra-high throughput, scalability, and speed. The technology is used to determine the order of nucleotides in entire genomes or targeted regions of DNA or RNA. NGS has revolutionized the biological sciences, allowing labs to perform a wide variety of applications and study biological systems at a level never before possible.

      Today's complex genomics questions demand a depth of information beyond the capacity of traditional DNA sequencing technologies. NGS has filled that gap and become an everyday tool to address these questions.

      Next-Generation Sequencing for Beginners

      We'll guide you through the basics of NGS, with tutorials and tips for planning your first experiment.

      See What NGS Can Do For You

      NGS technology has fundamentally changed the kinds of questions scientists can ask and answer. Innovative sample preparation and data analysis options enable a broad range of applications. For example, NGS allows labs to:

      • Rapidly sequence whole genomes
      • Deeply sequence target regions
      • Utilize RNA sequencing (RNA-Seq) to discover novel RNA variants and splice sites, or quantify mRNAs for gene expression analysis
      • Analyze epigenetic factors such as genome-wide DNA methylation and DNA-protein interactions
      • Sequence cancer samples to study rare somatic variants, tumor subclones, and more
      • Study the human microbiome
      • Identify novel pathogens

      Accessible Whole-Genome Sequencing

      Using capillary electrophoresis-based Sanger sequencing, the Human Genome Project took over 10 years and cost nearly $3 billion.

      Next-generation sequencing, in contrast, makes large-scale whole-genome sequencing (WGS) accessible and practical for the average researcher. It enables scientists to analyze the entire human genome in a single sequencing experiment, or sequence thousands to tens of thousands of genomes in one year.

      NGS Data Analysis Tools

      Explore user-friendly tools designed to make data analysis accessible to any scientist, regardless of bioinformatics experience.

      Broad Dynamic Range for Expression Profiling

      NGS-based RNA-Seq is a powerful method that enables researchers to break through the inefficiency and expense of legacy technologies such as microarrays. Microarray gene expression measurement is limited by noise at the low end and signal saturation at the high end.

      In contrast, next-gen sequencing quantifies discrete, digital sequencing read counts, offering a broader dynamic range. 1,2,3

      Tunable Resolution for Targeted NGS

      Targeted sequencing allows you to sequence a subset of genes or specific genomic regions of interest, efficiently and cost-effectively focusing the power of NGS. NGS is highly scalable, allowing you to tune the level of resolution to meet experimental needs. Choose whether to do a shallow scan across multiple samples, or sequence at greater depth with fewer samples to find rare variants in a given region.

      NGS for COVID-19

      Next-generation sequencing is uniquely positioned in an infectious disease surveillance and outbreak model. Learn which NGS methods are recommended for detecting and characterizing SARS-CoV-2 and other respiratory pathogens, tracking transmission, studying co-infection, and investigating viral evolution.

      How Does Illumina NGS Work?

      Illumina sequencing utilizes a fundamentally different approach from the classic Sanger chain-termination method. It leverages sequencing by synthesis (SBS) technology – tracking the addition of labeled nucleotides as the DNA chain is copied – in a massively parallel fashion.

      Next-generation sequencing generates masses of DNA sequencing data, and is both less expensive and less time-consuming than traditional Sanger sequencing. 2 Illumina sequencing systems can deliver data output ranging from 300 kilobases up to multiple terabases in a single run, depending on instrument type and configuration.

      Sequencing Technology Video

      In-Depth NGS Introduction

      This detailed overview of Illumina sequencing describes the evolution of genomic science, major advances in sequencing technology, key methods, the basics of Illumina sequencing chemistry, and more.

      What Can You Do with Next-Generation Sequencing?

      See how scientists utilize NGS to make breakthrough discoveries.
      Genetics of COVID-19 Susceptibility

      This UK-wide study uses NGS to compare the genomes of severely and mildly ill COVID-19 patients, to help uncover genetic factors associated with susceptibility.

      Exploring the Tumor Microenvironment

      Researchers use single-cell techniques to study cancer microenvironments, to elucidate gene expression patterns and gain insights into drug resistance and metastasis.

      Using NGS to Study Rare Diseases

      Whole-exome and transcriptome sequencing prove beneficial in uncovering mutations and pathways associated with rare genetic diseases.

      Evolution of Illumina NGS

      Recent Illumina next-generation sequencing technology breakthroughs include:

        : The iSeq 100 System combines a complementary metal-oxide semiconductor (CMOS) chip with one-channel SBS to deliver high-accuracy data in a compact system. : This technology enables faster sequencing than the original 4-channel version of SBS technology, with the same high data accuracy. : This option offers an exceptional level of throughput for diverse sequencing applications. : Learn how the NovaSeq 6000 System offers tunable output of up to 6 Tb in

      History of Illumina Sequencing

      Find out how Illumina SBS technology originated and evolved over time.

      Bring NGS to Your Lab

      The resources below offer valuable guidance to scientists who are considering purchasing a next-generation sequencing system.

      Download Buyer’s Guide

      NGS Experimental Considerations

      Learn about read length, coverage, quality scores, and other experimental considerations to help you plan your sequencing run.

      Use our interactive tools to help you create a custom NGS protocol or select the right products and methods for your project.

      Key Terms in NGS

      Use our next-generation sequencing glossary to clarify key terms and important concepts as you plan your sequencing project.

      Methods Guide

      Access the information you need—from BeadChips to library preparation for genome, transcriptome, or epigenome studies to sequencer selection, analysis, and support—all in one place. Select the best tools for your lab with our comprehensive guide designed specifically for research applications.

      Genomics News

      Illumina and Next Generation Genomic Launch Expanded NIPT in Thailand

      The collaboration will introduce VeriSeq™ NIPT Solution v2 in Southeast Asia

      Using Analytics to Improve Cancer Diagnosis and Therapy Selection

      Developing and automating best-practice workflows that make analyzing, processing, and disseminating genomic data accessible to researchers and clinicians.

      China’s Novogene is a Global Force

      The NGS services provider has completed 1.2 million samples—and they’re just getting started

      Interested in receiving newsletters, case studies, and information from Illumina based on your area of interest? S'inscrire maintenant.

      Related Solutions

      NGS Library Preparation

      Fast, simple NGS library prep and enrichment workflows from Illumina to prepare your samples for sequencing.

      Sequencing Services

      Access fast, reliable next-generation sequencing services that provide high-quality data and offer extensive scientific expertise.

      Illumina NGS & Microarray Training

      Work with expert Illumina instructors and get hands-on training. We also offer online courses, webinars, videos, and podcasts.

      Les références
      1. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 200910:57–63.
      2. Wilhelm BT, Landry JR. RNA-Seq—quantitative measurement of expression through massively parallel RNA sequencing. Méthodes. 200948:249–57.
      3. Zhao S, Fung-Leung WP, Bittner A, and Ngo K, Liu X. Comparison of RNA-Seq and microarray in transcriptome profiling of activated T cells. PLoS One. 2014169(1):e78644.

      Innovative technologies

      At Illumina, our goal is to apply innovative technologies to the analysis of genetic variation and function, making studies possible that were not even imaginable just a few years ago. It is mission critical for us to deliver innovative, flexible, and scalable solutions to meet the needs of our customers. As a global company that places high value on collaborative interactions, rapid delivery of solutions, and providing the highest level of quality, we strive to meet this challenge. Illumina innovative sequencing and array technologies are fueling groundbreaking advancements in life science research, translational and consumer genomics, and molecular diagnostics.

      For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures (except as specifically noted).


      Introduction

      Initial sequencing of the human genome took more than a decade and cost an estimated $70 million dollars (1). Sequencing for the Human Genome Project (HGP) relied primarily on automation of sequencing methods first introduced by Sanger in 1977 (2). Despite the successful use this technology to generate early maps of the human genome (3–5), the limitations of Sanger sequencing created a high demand for more robust sequencing technologies capable of generating large amounts of data, quickly, and at lower costs.

      Recognizing this need, the National Human Genome Research Institute (NHGRI) initiated a funding program in 2004 aimed at catalyzing sequencing technology development and with a goal of reducing the cost of genome sequencing to ∼$100,000 in 5 years and, ultimately, $1,000 in 10 years (6–8). The initiative has been widely successful to date, and a bevy of new technologies has emerged in the sequencing marketplace over the past 5 years. New technologies offer radically different approaches that enable the sequencing of large amounts of DNA in parallel and at substantially lower costs than conventional methods. Les termes "next-generation sequencing" et "massive-parallel sequencing” have been used loosely to collectively refer to these new high-throughput technologies.


      CONCLUSION

      This study has proved that RNA ligases derived from T4-phage exhibit significant sequence specificity in their activity. The profiles of small RNAs are strongly dependent on the adapters used for sample preparation. In light of this, the current, popular, sRNA-seq protocols need revision. We find that a mix of adapters, with different sequence ends, permits a more accurate estimation of the amounts of individual miRNA sequences and their isoforms. The use of RNA ligases in other protocols, such as oligoribonucleotide circularization ( 38), should be reviewed for possible effects of the bias discussed in this study.


      Voir la vidéo: CS50 Lecture by Mark Zuckerberg - 7 December 2005 (Août 2022).