Informations

Comment choisir un anticorps secondaire ?

Comment choisir un anticorps secondaire ?



We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

lorsque l'isotype de l'anticorps primaire est IgG2a (de souris) et IgG2b (de rat), comment choisir l'anticorps secondaire contre ces isotypes primaires ? L'anticorps secondaire est-il si spécifique pour détecter les IgG2a/2b ? Quelle est la logique derrière le choix des anticorps secondaires ? Une note détaillée à cet égard sera très appréciée.


Vous ne dites pas ce que vous faites, mais je pense que c'est un western blot - et pour cette application, il n'est pas important de savoir quel isotype possède votre anticorps. L'anticorps secondaire (qui est censé lier le primaire) doit être dirigé contre l'isotype (IgG par exemple) et l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été fabriqué, dans votre cas ce serait ce serait anti-souris ou anti- IgG de rat. Étant donné que la plupart des anticorps commercialisés en laboratoire sont des IgG, les gens n'y pensent généralement pas.

La raison en est que l'anticorps secondaire est dirigé contre la partie Fc de l'anticorps primaire (qui a une séquence spécifique à l'espèce) et même avec les différences dans les sous-classes dues à l'assemblage différent des chaînes légères et lourdes, cela ne sera pas détecté. par les secondaires. Voir la figure (d'ici) sur les différences schématiques :

Avec une sélection minutieuse des peptides utilisés pour l'immunisation, il est possible de générer des anticorps secondaires qui peuvent être utilisés pour distinguer les sous-classes.


Sélection d'anticorps secondaires

Les anticorps secondaires sont essentiels pour des expériences réussies impliquant des anticorps. Ils permettent la détection et l'amplification du signal tout en étendant l'utilité d'un anticorps par conjugaison à des protéines. Il existe plusieurs types différents d'anticorps secondaires et choisir le meilleur peut être un défi. L'article ci-dessous vous aidera à faire le meilleur choix.

Parcourir tous les anticorps secondaires

Quelle est l'espèce hôte de votre anticorps primaire ?

L'anticorps secondaire doit être dirigé contre l'espèce hôte de l'anticorps primaire. Par exemple, si l'anticorps primaire a été généré chez le lapin, le secondaire doit être anti-lapin

Figure 1. Espèce hôte d'anticorps primaire la plus courante.

Votre anticorps primaire est-il polyclonal ou monoclonal ?

Anticorps polyclonal

Un anticorps polyclonal contient un mélange de plusieurs isotypes d'immunoglobuline G (par exemple IgG1, IgG2a). Par conséquent, pour maximiser la détection de la cible, il est préférable d'utiliser un anticorps secondaire qui reconnaît tous les isotypes. Ce sont tous les anticorps secondaires qui sont marqués « IgG H+L » (H et L représentent respectivement les chaînes lourdes et légères des IgG). Cette désignation signifie que l'espèce hôte secondaire a été immunisée avec un pool d'IgG d'une autre espèce permettant à l'anticorps secondaire purifié de reconnaître toutes les formes.

Anticorps monoclonal

Un anticorps monoclonal contient un seul isotype d'immunoglobuline. Par conséquent, il est essentiel d'utiliser un secondaire qui reconnaît spécifiquement cet isotype. L'isotype de l'anticorps primaire doit être indiqué sur la fiche technique du produit.

Figure 2. Catégories d'anticorps : A) les anticorps polyclonaux se lient au même antigène, mais des épitopes différents et B) les anticorps monoclonaux se lient au même épitope sur un antigène cible.

Remarque : Si l'anticorps primaire est un fragment (pas l'anticorps entier), l'anticorps secondaire doit également être spécifique d'un fragment pour réduire le signal de bruit (par exemple, les anticorps secondaires du fragment F(ab')₂ pénètrent plus facilement les tissus dans l'IHC).

Quelle est votre méthode de détection de signal ?

Les anticorps secondaires peuvent être conjugués à une large gamme de produits chimiques, notamment des enzymes (peroxydase de raifort (HRP) ou phosphatase alcaline (AP)) et des fluorophores (par exemple, fluorescéine (FITC) ou cyanine (Cy3)).

Autres considérations

Purification:

Une technique de purification courante pour les anticorps secondaires est la purification à haute affinité, ce qui entraîne une réduction de la liaison non spécifique. De plus, les anticorps secondaires peuvent passer par une étape de purification supplémentaire pour réduire les réactions croisées potentielles avec d'autres espèces appelées adsorption croisée. Dans ce processus, la solution d'anticorps secondaire est passée sur différentes colonnes contenant des protéines de sérum de différentes espèces pour filtrer l'anticorps secondaire non spécifique (par exemple, pour une coloration multiple).

Western Blot après Immunoprécipitation :

Lors de l'utilisation du Western blot pour détecter une protéine dans des échantillons immunoprécipités, un soin particulier doit être apporté au choix des anticorps. Les échantillons immunoprécipités contiennent les chaînes lourdes et légères de l'anticorps pull-down. Ces chaînes apparaissent à 100 kDa et 50 kDa. Si l'anticorps secondaire reconnaît l'anticorps pull-down et l'anticorps primaire du Western blot, ces bandes apparaîtront à une intensité élevée et peuvent éclipser le signal de la protéine cible. Il est préférable d'utiliser une espèce différente pour l'anticorps primaire du Western Blot que l'anticorps pull-down. Si cela n'est pas possible, il est recommandé d'utiliser un secondaire qui reconnaît la chaîne spécifique la plus éloignée de votre protéine cible ou d'utiliser un anticorps secondaire qui préfère les formes natives aux formes dénaturées.


La différence entre l'anticorps primaire et l'anticorps secondaire

Quelle est la différence entre un anticorps primaire et un anticorps secondaire ? C'est une question fréquemment posée par les mains vertes du laboratoire. Ici, nous répondrons à cette question sous cinq angles : capacité de liaison, utilisation et étiquette, source, clonalité et pré-adsorption.

Les anticorps (Ac) sont largement utilisés pour la recherche. Selon leur capacité de liaison, les anticorps peuvent être classés en deux types : les anticorps primaires et les anticorps secondaires. Plus précisément, les anticorps primaires sont des anticorps qui se lient à la protéine ou à l'antigène (Ag) ou à toute substance que vous étudiez, tandis que les anticorps secondaires sont ceux qui se lient aux anticorps primaires. Regardez la figure 1 ci-dessous :

Fig. 1 Ab primaire VS. Ab secondaire

Si vous avez lu notre article précédent Qu'est-ce qu'un anticorps ? vous acquerrez une bonne connaissance de la structure des anticorps, et vous comprendrez alors plus facilement que le domaine Fab de l'anticorps primaire se lie à un antigène et expose son domaine Fc à l'anticorps secondaire, et donc que le domaine Fab de l'anticorps secondaire se lie au primaire domaine Fc de l'anticorps.

Puisque le domaine Fc est le même dans toutes les molécules d'anticorps de la même classe dans une espèce donnée, un type d'anticorps secondaire est capable de se lier à de nombreux types d'anticorps primaires. Par exemple, lorsque des anticorps de la classe IgG élevés chez la souris sont utilisés comme anticorps primaire, un anticorps qui cible le domaine IgG Fc de souris et n'est pas élevé chez la souris peut être utilisé comme anticorps secondaire.

Dans les dosages immunologiques, un anticorps primaire est toujours nécessaire pour se lier à l'antigène cible, mais un anticorps secondaire n'est pas nécessairement utilisé. Prenons comme exemple l'ELISA direct et l'ELISA indirect. L'ELISA direct implique un marquage direct, ce qui signifie que l'anticorps primaire est directement marqué avec une enzyme pour la réaction enzymatique et la détection du signal, et qu'il n'est pas nécessaire d'avoir un anticorps secondaire. L'ELISA indirect ne marque pas directement l'anticorps primaire, mais à la place, il marque l'anticorps secondaire avec une enzyme, comme le montre la figure 2 ci-dessous.

Fig. 2 ELISA direct VS. ELISA indirect

Que ce soit pour marquer l'anticorps primaire (marquage direct) ou l'anticorps secondaire (marquage indirect) dépend de votre expérience. L'étiquetage direct ou l'étiquetage indirect a ses avantages et ses inconvénients. Le marquage direct est généralement associé à un protocole simple qui permet d'économiser du temps et des réactifs, ne présente aucun risque de réactivité croisée avec l'anticorps secondaire, mais manque d'amplification du signal et de flexibilité et peut entraîner un bruit de fond élevé. Le marquage indirect implique une amplification du signal, est très flexible car le même anticorps secondaire peut réagir avec plusieurs anticorps primaires, mais présente un protocole relativement complexe et un risque de réactivité croisée.

La source des anticorps est un aspect important qui doit être pris en compte. L'espèce hôte de l'anticorps primaire doit être différente de l'espèce de votre échantillon, afin d'éviter une réactivité croisée de l'anticorps secondaire avec les immunoglobulines de l'échantillon. De plus, l'espèce hôte de l'anticorps secondaire doit être différente de l'espèce hôte de l'anticorps primaire, puisque l'anticorps secondaire doit être dirigé contre l'espèce de l'anticorps primaire.

Par exemple, si vous étudiez un échantillon de souris, vous aurez besoin d'un anticorps primaire généré chez des animaux autres que la souris, tels que ceux générés chez le lapin. Ensuite, si vous utilisez un anticorps de lapin dirigé contre la souris comme anticorps primaire, vous aurez besoin d'un anticorps secondaire généré chez des animaux autres que le lapin, tels que ceux générés chez la chèvre.

Pour permettre la détection de l'antigène cible, l'anticorps secondaire doit non seulement avoir une spécificité pour l'espèce de l'anticorps primaire, mais également avoir une spécificité pour l'isotype de l'anticorps primaire. Par exemple, si l'anticorps primaire est un anticorps IgG1 élevé chez le lapin, vous aurez besoin d'un anticorps secondaire qui peut réagir avec l'anticorps IgG1 du lapin et qui n'est pas généré chez le lapin.

L'anticorps primaire peut être soit un anticorps monoclonal (mAb) soit un anticorps polyclonal (pAb).

Comparons d'abord les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux. Les anticorps monoclonaux ne reconnaissent qu'un seul épitope sur un antigène, tandis que les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes sur un antigène. Pour cette raison, les anticorps monoclonaux et les anticorps polyclonaux ont des propriétés et des utilisations différentes. Les anticorps monoclonaux ont une spécificité élevée et une reproductibilité élevée, provoquant moins de bruit de fond de coloration par rapport aux anticorps polyclonaux. Cependant, en raison de leur spécificité élevée, les anticorps monoclonaux peuvent ne pas fonctionner lorsque l'épitope cible est modifié par un traitement chimique de l'antigène. En revanche, les anticorps polyclonaux ont une affinité élevée, tolèrent des modifications mineures de l'antigène et permettent une détection plus robuste. Mais les anticorps polyclonaux ont une variabilité de lot à lot plus élevée et sont plus susceptibles de créer un bruit de fond élevé à partir de la coloration.

Si votre expérience nécessite une spécificité élevée, l'utilisation d'anticorps monoclonaux comme anticorps primaires peut être un bon choix. Si le signal positif est faible, essayez les anticorps polyclonaux. Étant donné que les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes, ils sont plus susceptibles de donner de meilleurs résultats en immunoprécipitation (IP) et en immunoprécipitation de la chromatine (ChIP). Mais si vous souhaitez sonder des domaines spécifiques de l'antigène, les anticorps polyclonaux ne sont pas utiles et les anticorps monoclonaux en tant qu'anticorps primaires pourraient être meilleurs.

L'anticorps secondaire peut être soit un anticorps monoclonal, soit un anticorps polyclonal qui se lie à l'anticorps primaire ou à ses fragments. Il existe différentes formes d'anticorps secondaires. Premièrement, un anticorps secondaire peut être dirigé contre la molécule entière de l'anticorps primaire. Par exemple, un anticorps primaire est généralement un isotype IgG. Ensuite, vous aurez besoin d'un anticorps anti-IgG H&L (chaînes lourdes et légères) comme anticorps secondaire, qui réagit à la fois avec les chaînes lourdes et légères de l'anticorps IgG primaire. De plus, cet anticorps anti-IgG H&L réagit également avec d'autres classes d'immunoglobulines telles que les IgM et IgA de l'espèce de l'anticorps primaire, car toutes les immunoglobulines d'une espèce donnée ont les mêmes chaînes légères. Deuxièmement, un anticorps secondaire peut être spécifique de la région Fab de l'anticorps primaire. De même, cette forme d'anticorps secondaire réagit également avec les chaînes lourdes et légères, et réagit donc avec d'autres classes d'immunoglobulines avec les mêmes chaînes légères. Troisièmement, un anticorps secondaire peut être spécifique de la région Fc de l'anticorps primaire, ce qui signifie qu'il ne réagit qu'avec la chaîne lourde. Ainsi, cet anticorps secondaire ne réagit qu'avec une seule classe d'immunoglobulines, comme les IgG ou les IgM. Enfin, un anticorps secondaire peut être spécifique de la chaîne légère de l'anticorps primaire, il réagira donc avec toutes les classes d'immunoglobulines ayant la même chaîne légère.

Les anticorps secondaires nécessitent parfois un processus de purification supplémentaire, appelé pré-adsorption, pour augmenter la spécificité et minimiser les non-spécifiques. Au cours de la pré-adsorption, la solution contenant des anticorps secondaires est passée à travers une matrice de colonne contenant des protéines sériques immobilisées ou des immunoglobulines provenant d'espèces potentiellement à réaction croisée (telles que l'espèce de l'échantillon). Grâce à ce processus, les anticorps non spécifiques dans la solution seront éliminés, tandis que les anticorps secondaires hautement spécifiques sont laissés. Par exemple, si vous travaillez avec des tissus de souris, choisissez un anticorps secondaire qui a été adsorbé avec du sérum de souris ou des IgG de souris.

Les anticorps secondaires pré-adsorbés produisent moins de liaison non spécifique et sont donc moins susceptibles de créer un arrière-plan non spécifique. Lorsque vous déterminez l'expression des protéines dans plusieurs expériences de marquage ou lorsque vous étudiez des tissus ou des cellules riches en immunoglobulines, il est recommandé d'utiliser un anticorps secondaire pré-adsorbé.

En résumé, il existe plusieurs différences entre les anticorps primaires et les anticorps secondaires. Premièrement, les anticorps primaires et les anticorps secondaires ont des capacités de liaison différentes. Les anticorps primaires se lient à l'antigène détecté, tandis que les anticorps secondaires se lient aux anticorps primaires, généralement leur domaine Fc. Deuxièmement, les anticorps primaires sont toujours nécessaires dans les immunoessais, alors que les anticorps secondaires ne sont pas nécessairement nécessaires, ce qui dépend de la méthode expérimentale (marquage direct ou indirect). Troisièmement, l'espèce d'anticorps primaires dans laquelle sont générés n'est pas la même espèce que l'échantillon, et l'espèce d'anticorps secondaire dans laquelle sont générés est différente de l'espèce source d'anticorps primaires. Quatrièmement, les anticorps primaires et les anticorps secondaires peuvent être soit monoclonaux, soit polyclonaux, mais il y a différentes choses à considérer dans la sélection de leur clonalité. Enfin, les anticorps secondaires ont parfois besoin d'être pré-adsorbés, alors qu'il n'y a généralement pas un tel besoin d'anticorps primaires.

Maintenant, vous pouvez mieux comprendre la différence entre les anticorps primaires et les anticorps secondaires et il sera plus facile de sélectionner les bons anticorps pour vos expériences. Choisir le bon anticorps n'est jamais une tâche facile. Si vous avez choisi un anticorps qui ne convient pas à votre expérience, vous risquez de perdre de l'argent, du temps et de précieux échantillons. Pour simplifier la sélection des anticorps, vous pouvez continuer à lire un autre article sur notre site : Comment choisir un anticorps pour la recherche scientifique ?


Optimiser votre protocole de blocage

L'objectif de tous les agents bloquants est le même : améliorer la sensibilité de votre test d'immunohistochimie en réduisant le bruit de fond non spécifique et en améliorant votre rapport signal/bruit. Cependant, votre meilleur protocole de blocage dépendra de votre type d'échantillon, de la source d'anticorps, de la méthode de détection* et de l'existence d'interactions protéine-protéine imprévues. Par conséquent, vous devrez tester plusieurs bloqueurs et conditions pour déterminer empiriquement votre méthode de blocage optimale.

* Tous les agents bloquants et tampons ne sont pas compatibles avec toutes les méthodes de détection. Par exemple, les conjugués de phosphatase alcaline ne sont compatibles avec aucun conservateur à base d'azoture de sodium dans vos tampons, et le système complexe avidine-biotine n'est pas compatible avec le lait en poudre écrémé.


Perméabilisation et Fixation

La coloration des antigènes intracellulaires comme les cytokines peut être difficile car les sondes à base d'anticorps ne peuvent pas passer facilement à travers la membrane plasmique à l'intérieur de la cellule. Pour ce faire, les cellules doivent d'abord être fixées en suspension puis perméabilisées avant d'ajouter l'anticorps. Le choix du fixateur est une première étape importante. Le formaldéhyde et le glutéraldéhyde créent des liaisons entre les résidus de lysine résultant en des protéines réticulées, cependant le glutéraldéhyde augmente l'autofluorescence. Il est généralement utilisé à des concentrations de 0,5 à 4 % dans le PBS selon l'échantillon. Si vous prévoyez de stocker vos échantillons pendant de longues périodes, ils doivent être retirés du fixateur après 1 à 2 heures.

Le formaldéhyde ne perméabilisera pas les échantillons, une étape de perméabilisation distincte est donc nécessaire. Cela permet aux sondes d'accéder aux structures intracellulaires tout en laissant intactes les caractéristiques de dispersion morphologique des cellules. Le triton, la digitonine et la saponine sont des exemples de réactifs de perméabilisation qui agissent en perturbant la membrane cellulaire. Le niveau de perméabilisation est important car l'accès aux épitopes peut nécessiter différents niveaux de perméabilisation (par exemple, épitopes cytoplasmiques vs nucléaires) et l'anticorps non lié doit être suffisamment éliminé des cellules par lavage. Il existe également de nombreux kits commerciaux disponibles aujourd'hui qui fournissent les réactifs pour effectuer à la fois la fixation et la perméabilisation, par exemple, Leucoperm&trade (Figure 28).

28. Coloration intracellulaire. Le sang total humain (A) a été coloré en surface pour le CD4 suivi d'une coloration intracellulaire pour l'IFN-gamma, sur des lymphocytes au repos (B) ou des lymphocytes stimulés avec du PMA/Ionomycine et traités avec de la monensine (C) avant coloration.


BSA versus lait dans le blocage et l'incubation d'anticorps - (30 novembre 2011 )

Je n'ai pas réussi à voir un signal de ma protéine de faible poids moléculaire (16kda), j'ai fait 15% de SDS-PAGE et j'ai bloqué la membrane dans 5% de lait, les incubations primaires (monoclonales) et secondaires diluées dans 5% de lait également.
Certaines personnes me suggèrent d'essayer le BSA au lieu du lait.
En fait, j'ai incubé à nouveau le même filtre avec des anticorps dilués dans du lait pendant la nuit à 4°C.
Je me demande si je peux faire des anticorps secondaires dilués dans du BSA ?? ou je dois le garder dans du lait ?
Merci

luciana ce qui est arrivé à votre blot.je veux connaître le résultat.je vais travailler sur le transfert de protéines 17kd à l'avenir.

Salut,
après avoir rebouché le filtre avec du BSA 5% et des anticorps dilués dans du BSA. J'ai eu un signal avec un arrière-plan. Mais j'ai remarqué que 15% n'est pas vraiment nécessaire. Je peux garder 10% de becos Il semble que cette protéine ait un trimère à 55kda. Je n'ai pas pu voir 16kda!

les lavages se font pendant 10 minutes toutes les 3 fois après le blocage, l'incubation primaire des abdominaux et l'incubation secondaire des abdominaux, cela réduira le fond correctement, ce qui m'est arrivé. dans votre cas trimer votre dire mais votre gel, gel réducteur SDS est-il correct? alors comment se fait-il que trimer? avez-vous chauffé l'échantillon pendant 5 minutes avant de le charger.?


Guide d'immunohistochimie (IHC) et dépannage


L'immunohistochimie est une technique de laboratoire utilisée pour la détection visuelle des antigènes dans les tissus. Lorsque l'on travaille avec des cellules, cette technique est généralement appelée immunocytochimie. Ces techniques sont largement utilisées par les laboratoires d'histologie/pathologie et les chercheurs en sciences de la vie comme méthode pour détecter des cellules anormales ou pour caractériser la localisation de protéines dans un échantillon biologique. La détection visuelle est réalisée en utilisant des anticorps qui ont été chimiquement conjugués avec un marqueur tel qu'un colorant fluorescent, une enzyme, un élément radioactif ou de l'or colloïdal. La réaction finale anticorps-antigène est visible au microscope optique ou à fluorescence selon les anticorps marqués utilisés pour la détection.
[retour au sommet]

Sélection des anticorps :

Il y a de nombreux facteurs à considérer lors du choix d'un anticorps primaire car il y a des avantages et des inconvénients à utiliser un anticorps primaire monoclonal ou polyclonal. Les anticorps monoclonaux sont générés par un seul clone de lymphocytes B provenant d'un animal, ce qui donne une population homogène d'immunoglobulines dirigées contre un seul épitope. Les anticorps polyclonaux sont développés par plusieurs clones de cellules B de l'animal, ce qui donne un mélange hétérogène d'anticorps dirigés contre divers épitopes du même antigène.

En général, les chercheurs peuvent choisir un anticorps monoclonal car les lots produits à partir de la lignée d'hybridomes établie permettent une production identique, donc une standardisation. De plus, ils sont moins susceptibles d'avoir une coloration de fond et ils sont moins susceptibles d'avoir une réactivité croisée avec d'autres protéines. Étant donné que les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes sur le même antigène, ils sont plus tolérants aux changements mineurs de l'antigène pendant la fixation et le traitement. De plus, les anticorps polyclonaux peuvent amplifier le signal de détection de l'antigène et sont la méthode préférée lors de l'utilisation de protéines dénaturées.

Les espèces contre lesquelles les anticorps ont été produits doivent également être prises en compte lors du choix des anticorps pour l'IHC. Pour fournir les bruits de fond les plus bas, les anticorps primaires et secondaires doivent être dirigés contre la même espèce.
[retour au sommet]

Méthodes/Protocoles :

Préparation de l'échantillon : Fixation

La première étape consiste à collecter l'échantillon de tissu. La collecte correcte du tissu est une étape extrêmement importante car elle évitera la dégradation de l'échantillon et maintiendra la qualité. Les facteurs qui peuvent affecter la qualité comprennent le temps jusqu'à la fixation et la température de l'échantillon. De plus, le tissu doit être placé dans une solution de fixation dès que possible.

Les fixateurs sont utilisés pour immobiliser les antigènes tout en conservant les structures cellulaires et subcellulaires grâce à la réticulation des ponts méthylène et des bases de Schiff entre les résidus d'acides aminés basiques des protéines. Il existe une variété de fixateurs utilisés pour l'IHC et aucun n'est idéal pour tous les anticorps et toutes les applications. Le fixateur le plus couramment utilisé est le formol neutre tamponné à 10 %. D'autres comprennent le méthanol, l'éthanol et l'acétone qui peuvent être utilisés pour la fixation et la perméabilisation de la membrane.
[retour au sommet]

Préparation de l'échantillon : enrobage

Il existe également divers composés d'enrobage qui peuvent être utilisés pour soutenir le tissu pendant le traitement/la coupe. Les coupes congelées sont idéales pour un traitement rapide et les situations où l'anticorps peut ne pas être compatible avec les composés de paraffine. Les sections congelées sont généralement utilisées pour les méthodes de détection par immunofluorescence directe ou indirecte et sectionnées à une épaisseur de 10 microns. Le deuxième type et le plus courant de milieu d'enrobage est la paraffine. La paraffine est utilisée pour une préservation maximale des tissus et constitue un bloc plus solide pour la coupe des tissus. En règle générale, les sections de paraffine sont coupées entre 3 et 5 microns d'épaisseur.
[retour au sommet]

Récupération d'antigène :

Démasquer l'antigène est parfois nécessaire car le processus de paraffinisation et l'utilisation de fixateurs puissants peuvent inhiber l'attachement des anticorps primaires à l'antigène. Il existe deux processus courants pour la récupération d'antigènes : la digestion par la chaleur et la digestion enzymatique. Ces deux techniques servent à rompre les liaisons croisées et à exposer l'antigène. De plus, une étape de déparaffinage est utilisée sur des coupes de tissus inclus en paraffine grâce à un processus de série de lavages à l'alcool.

Lors de l'utilisation des réactifs de digestion enzymatique, il est important de ne pas trop ou sous-digérer - le temps de digestion doit être optimisé. Les enzymes utilisées comprennent la pronase, la trypsine, la pepsine et la protéinase K. La récupération d'antigène induite par la chaleur peut être effectuée à l'aide d'un autocuiseur, d'un micro-ondes, d'un autoclave ou d'un bain-marie.
[retour au sommet]

Immunomarquage :

L'immunocoloration est le processus d'incubation des tissus/cellules avec des anticorps pour former le complexe antigène-anticorps pour la détection/le signal de l'antigène ciblé. La détection est généralement réalisée à l'aide d'une réaction colorimétrique (enzymatique) ou d'un signal fluorescent généré à partir d'une source ultraviolette.

Il existe plusieurs techniques de marquage, notamment directes, indirectes et indirectes avec amplification du signal. Le marquage direct utilise un anticorps primaire directement conjugué à une source de signalisation, tandis que le marquage indirect a un anticorps secondaire générant un signal qui se fixera à l'anticorps primaire en contact avec l'antigène. Par exemple, un anticorps primaire produit à partir de lapin serait détecté en utilisant un anticorps secondaire qui est anti-lapin et conjugué à une sonde de détection. Enfin, la technique d'amplification indirecte avec signal est réalisée en utilisant un anticorps secondaire biotinylé et un réactif d'amplification tel que la streptavidine.

Les techniques d'immunofluorescence utilisent des anticorps conjugués chimiquement à des colorants fluorescents visibles sous une lumière UV. Deux colorants populaires sont l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et l'isothiocyanate de rhodamine (TRITC).

Les réactions colorimétriques utilisent des anticorps conjugués chimiquement aux enzymes peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline. L'enzyme catalyse la réaction du substrat en formant un précipité coloré. Les substrats courants comprennent la diaminobenzidine (DAB), le 3-amino-9-éthylcarbazole (AEC), le 4-chloro-1-naphtol (4-CN) et le bromochloroindolyphosphate/Nitro Blue Tetrazolium (BCIP/NBT).
[retour au sommet]

Dépannage:

Les problèmes courants rencontrés incluent une coloration insuffisante, trop de coloration ou un fond élevé.

Pas de coloration

Problème Solutions possibles)
L'anticorps primaire et l'anticorps secondaire peuvent ne pas correspondre. Il est recommandé que l'anticorps secondaire soit dirigé contre l'espèce dans laquelle l'anticorps primaire a été produit (par exemple, si l'anticorps primaire est produit chez la souris, utilisez un anticorps secondaire anti-souris).
L'anticorps peut ne pas convenir aux procédures IHC qui révèlent la protéine sous sa forme native (non dénaturée). Testez l'anticorps sur un western blot non dénaturé et dénaturé pour vous assurer que l'anticorps reconnaît l'antigène non dénaturé.
L'anticorps secondaire n'a pas été stocké dans l'obscurité. Il est recommandé d'éviter d'exposer l'anticorps secondaire à la lumière.
Pas assez d'anticorps primaire se lie à la protéine d'intérêt. Diluez moins l'anticorps.
incuber plus longtemps à 4°C.
La protéine d'intérêt n'est pas présente en abondance dans le tissu. Exécutez un contrôle positif.
L'utilisation d'une étape d'amplification peut aider à amplifier le signal.
Utilisez une dilution inférieure d'anticorps primaire.
La protéine d'intérêt est une protéine nucléaire et l'anticorps ne peut pas pénétrer dans le noyau. Pour faciliter la pénétration du noyau, ajouter un agent perméabilisant au tampon de blocage et au tampon de dilution d'anticorps.
La déparafinisation peut être insuffisante Déparaffiner les sections plus longtemps.
Utilisez du xylène fraîchement préparé.
Des fixateurs tels que le formol et le paraformaldéhyde peuvent modifier l'épitope reconnu par l'anticorps. Utilisez la méthode de récupération d'antigène pour démasquer l'épitope.
Correction pour moins de temps.
Le tampon PBS peut être contaminé par des bactéries qui ont endommagé la protéine d'intérêt. Utilisez un conservateur tel que 0,01 % d'azoture dans le tampon de stockage d'anticorps PBS.
utiliser du PBS stérile frais.

Fond élevé

Problème Solutions possibles)
Le blocage de la liaison non spécifique peut être insuffisant. Augmenter la période d'incubation de blocage à 30 min pour les sections et 1 heure pour la culture cellulaire. Utilisez un agent bloquant tel 10 % de sérum normal pour les coupes et 1 à 5 % de BSA pour la culture cellulaire.
La concentration d'anticorps primaires peut être trop élevée. Titrer l'anticorps à une concentration plus optimale, incuber plus longtemps en utilisant plus de dilution. Cela fournira une liaison plus lente mais plus spécifique.
L'anticorps secondaire peut se lier de manière non spécifique. Exécutez un contrôle secondaire sans anticorps primaire.
La température d'incubation peut être trop élevée. Incuber les coupes de tissus ou les cellules à 4°C.
Tissu pas suffisamment lavé. Laver abondamment avec du PBS entre toutes les étapes
Les peroxydases endogènes sont actives. Utilisez des inhibiteurs enzymatiques tels que Levamisol (2 mM) pour la phosphatase alcaline ou H2O2 (0,3 % v/v) pour la peroxydase.
Les fixateurs tels que le formol et le paraformaldéhyde sont trop puissants et peuvent avoir modifié l'épitope reconnu par l'anticorps. Changer les méthodes de récupération des antigènes.
Diminuer le temps d'incubation avec la solution de démasquage d'antigène.
Trop de substrat a été appliqué. Réduire le temps d'incubation du substrat.
Le chromogène réagit avec le PBS présent dans les cellules. Utiliser un tampon Tris pour laver les coupes avant l'incubation avec le substrat.
La péméabilisation a endommagé la membrane et éliminé la protéine membranaire. Retirez l'agent perméabilisant de vos tampons.

Coloration non spécifique

Problème Solutions possibles)
La concentration de l'anticorps primaire ou secondaire peut être trop élevée. Essayez de diminuer la concentration d'anticorps et/ou la période d'incubation. Comparez l'intensité du signal avec les cellules qui n'expriment pas la cible.
L'anticorps primaire est dirigé contre la même espèce que le tissu coloré (par exemple, un anticorps primaire de rat testé sur du tissu de rat). Lorsque l'anticorps secondaire est appliqué, il se lie à tous les tissus puisqu'il a également été élevé contre cette espèce. Utilisez des anticorps primaires/secondaires dirigés contre une espèce différente de votre tissu.
Les peroxydases endogènes sont actives. Utilisez des inhibiteurs enzymatiques tels que Levamisol (2 mM) pour la phosphatase alcaline ou H2O2 (0,3 % v/v) pour la peroxydase.
Les sections/cellules ont séché. Conservez les coupes de tissus et les cellules à une humidité élevée et ne les laissez pas sécher.

Informations connexes :

Comparaison du formaldéhyde et du formol :

Formaldéhyde:
Le formaldéhyde est un gaz incolore connu par la formule chimique de CH2O.

Formol:
Lorsque le gaz formaldéhyde est dissous dans l'eau, il se sature en solution à 37 % (en poids) ou 40 % (en volume) et est appelé formaldéhyde 37-40 %, formol 100 % ou formol fort. Le mot formol est utilisé pour désigner des solutions de formaldéhyde gazeux dissous dans l'eau. Le formol stocké contient environ 10 % de méthanol pour ralentir la polymérisation qui conduit à la précipitation du paraformaldéhyde. Les solutions de formol couramment utilisées comme fixateur comprennent :
• 10 % de NBF (formol tamponné neutre) :
- 100 ml 100% formol
- 900 ml d'eau.
- 4 grammes de phosphate monosodique monohydraté (NaH2Bon de commande4H2O)
- 6,5 grammes d'hydrogénophosphate disodique anhydre (Na2HPO4)
- La concentration finale contient 4% de formaldéhyde.
• Formol solution saline :
- 100 ml 100% formol
- 900 ml d'eau
- 8,5 grammes de chlorure de sodium.
• 10% de formol :
- 100 ml 100% formol
- 900 ml d'eau

Paraformaldéhyde :
Le paraformaldéhyde est la forme polymérisée du formaldéhyde. Il est utilisé pour fabriquer des solutions de formol sans méthanol qui ne contiennent pas d'acide formique lors de leur première fabrication.
• 4 % de paraformaldéhyde :
- 40 grammes de paraformaldéhyde
- Faire un litre avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
- Chauffer la solution sous hotte à 60ºC - 70ºC et ajouter des gouttes de NaOH 10M jusqu'à ce que la solution soit claire. Filtrer la solution finale.


ProSci Incorporated a développé et fabriqué des anticorps, des antigènes et d'autres réactifs liés au SARS-CoV-2 (COVID-19, 2019-nCoV) liés à l'entrée cellulaire : récepteur ACE2, TMPRSS2 et enzyme furine. ProSci Inc. ajoute continuellement de nouveaux réactifs SARS-CoV-2 pour pointe, S1, S2, nucléocapside, membrane, enveloppe, y compris des anticorps à domaine unique de lama et des protéines recombinantes. Nous avons des protéines recombinantes SARS-CoV-2 (2019-nCoV), des anticorps validés par des échantillons de patients COVID-19 et développons activement de nouveaux produits contre les coronavirus. De plus, nos services d'anticorps personnalisés soutiennent la recherche sur le SRAS-CoV-2 dans le développement d'outils de recherche, de diagnostics, de thérapies et de vaccins.

Réactifs SARS-CoV-2

ProSci propose des anticorps et des protéines recombinantes pour toutes les protéines structurelles du SRAS-CoV-2.

Variantes du SRAS-CoV-2

Protéines RBD pour les variantes COVID-19 : Alpha, Beta, Gamma disponibles pour la recherche !

Réactifs à cadre de lecture ouvert SARS-CoV-2

ProSci possède un catalogue d'anticorps et de protéines contre de nombreuses protéines accessoires de l'ORF.

Anticorps à paires appariées SARS-CoV-2

Ces paires comprennent des anticorps contre les protéines spike s1, spike RBD et nucléocapside.

Anticorps validés avec des échantillons de patients

ProSci renforce les efforts de recherche à l'échelle mondiale pour comprendre ce virus et ses effets sur la santé. ProSci offers antibodies against structural SARS-CoV-2 proteins validated with COVID-19 positive patient tissue samples.

COVID-19 Small Molecules

Several strategies are being taken for SARS-CoV-2 antiviral drug discovery. ProSci offers several drugs that have helped in the exploration of the SARS-CoV-2 life cycle and its mode
of infection.

ACE2 and Related Targets

Angiotensin-converting enzyme 2, has been shown to be the receptor for SARS-CoV-2 through binding of its Spike protein.

Infectious Disease Research Reagents

ProSci offers antibodies and proteins to over 20 infectious disease targets.

Influenza Virus Research Reagents

Antibodies and recombinant proteins for influenza virus targets such as H5N1, H1N1, and more!

Cytokine Storm

ProSci offers antibodies and recombinant proteins for many factors involved in the inflammatory response.

5A's Antibody Guide

Inside our antibody development guide section, you will find information about how our custom antibody services work, the challenges we face, and how we resolve them.

San Diego Company

ProSci is proud to be a local San Diego antibody company devoted to R&D and committed to the design, development, and production of high-performance antibodies.

ProSci Blog

Learn more about ProSci's experience with creating antibodies for difficult antigens and new developments in antibody research through our blog posts.

Broad Antibody Catalog | Extensive Antibody Services | Established in 1998


School of Medicine Columbia

We are primarily involved in teaching, research and service. Our research is well-funded by grant support from federal sources such as the National Institutes of Health and from private foundations. Such support has resulted in high-quality publications in scientific journals as well as presentations at regional, national and international conferences.

Interdisciplinary Approach

Our department offers a highly interactive research environment conducive to collaborations on interdisciplinary and multidisciplinary research projects with others in our school, university and beyond, as evidenced by extramurally-funded center and program project grants.

Service

Our faculty direct state-of-the-art cores such as the Flow Cytometry and Sorting. Our other shared resources comprise cutting-edge equipment and technology for Advanced Microscopy, –Omics (Genomics, Epigenomics, Transcriptomics and Microbiome technology) and Metabolic Profiling studies. We welcome you to visit us to see our equipment and resources first-hand.

Faculty

Our faculty are recognized leaders in their fields. They are appointed to national and international grant-review committees, hold offices in scientific societies, organize conferences and serve on government-appointed panels and scientific journal editorial boards. They participate in teaching courses primarily for medical and graduate students, as well as for post-baccalaureate and physician assistant students.

Core Courses

A seven-credit-hour, fall semester, second-year course covering fundamental and clinical aspects of microbiology and immunology as they relate to bacteria, viruses, fungi and parasites. Infectious agents are discussed in relation to their morphology, biology, epidemiology and pathogenesis.

The role of the specific and nonspecific immune systems in defense against infection and disease, as well as in the causation of disease (immunopathogenesis), is emphasized. A section of the course is devoted to special topics in infectious diseases. Primary methods of instruction include lecture, case-based discussion/presentation, patient-oriented problem-solving exercises, clinical correlations and laboratory. Modes of assessment include departmental written multiple choice examination and an assessment of participation in problem-solving exercises, case study discussions and computer simulated laboratory exercises.

A two-semester, seven-credit-hour (PAMB 641 - fall) and six-credit-hour (PAMB 642 - spring), second-year course that provides students with an understanding of the basic mechanisms of diseases, the body’s response to these diseases and the manifestation of these changes in patient signs, symptoms and tests in specific organ systems. Primary methods of instruction include lecture and small-group discussion. Modes of assessment include a NBME subject examination and departmental multiple choice examinations.

This graduate level course covers immune system components, including the innate and adaptive immune system, their functions and interactions. Topics on immune system dysregulation and consequences as related to disease and health are included. Current topics of interest in immunology also are covered. Overall, students will gain an advanced understanding of the immune system.

By the end of this course the student will demonstrate knowledge and understanding in:

  1. the components of the immune system and their functions.
  2. interactions between immune system components.
  3. immune system dysregulation and consequences.
  4. immune response during health and disease.

In this course, students learn and understand the following topics:

  • Apoptosis and its implications in neurodegenerative and malignant diseases
  • Proteomics in biomedical science
  • Basic concepts of stem cells and their roles in diseases
  • Roles of G-proteins in cell signaling in various disease processes
  • development of gene therapy approaches and gene therapy based therapeutics for basic and clinical applications

A minimum of 4 students is required to conduct this course.

In this course, students learn and understand the following topics:

  • Basic components of different neoplastic diseases and general pathology of neoplasia
  • Mechanisms of metastasis, oncogenes, tumor suppressor genes and telomerase
  • AIDS related malignancies
  • Signaling pathways in cancer
  • DNA and RNA tumor viruses apoptosis and cancer
  • Stem cells and cancer
  • HPV vaccines cancer epidemiology and chemoprevention
  • Environmental carcinogenesis
  • Animal models in cancer research and cancer chemotherapy

A minimum of 4 students is required to conduct this course.

This course is offered in Fall and Spring semesters, primarily to graduate students who have a background in basic Immunology. The format of the course is as a journal club wherein 2-3 papers will be discussed on a weekly basis on current immunology literature that has appeared in high-impact journals like Science, Nature, Nature Medicine, Nature Immunology, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, Journal of Experimental Medicine, Journal of Immunology, Cell and Immunity.

The scientific paper discussion will include Introduction, Materials and Methods, Results, Discussion and Bibliography. One of the most important aspects of this course is to train the student to critique research and to improve the quality of their research by incorporating novel concepts and techniques.

This course is designed to provide graduate students with a fundamental biomedical knowledge base in human pathology and an introduction to the study of the disease process. Particular emphasis will be given to the etiology, pathogenesis and description of gross and microscopic pathologic patterns occurring during the progress and outcome of major human diseases and conditions.

Students will be introduced to the experimental approach of the development and subsequently effective treatment of certain diseases, through the description of animal models simulating related pathologies. With the knowledge of normal histology, and by gaining familiarity of microscopic appearances through a hands-on experience at the lab small groups, students will develop observational and descriptive skills and ultimately deepen thier understanding of the underlying mechanisms of disease. By the description of the experimental methodologies, including the murine models of various diseases, they will formulate the causative approach in the study of disease.

Research Area Focus Groups

The research interests of our faculty fall under the following main thematic groups.

Expand all Inflammatory and Autoimmune Diseases

    - Epigenetic regulation of inflammatory and autoimmune diseases, including multiple sclerosis and autoimmune hepatitis. - Effect of microbiome in inflammatory diseases such as colitis, obesity and cancer. – Role of macrophage-induced inflammation in colon cancer. – Targeting skin inflammation in atopic dermatitis. – Interaction of primary antibody deficiency and inflammation caused by host-microbiome dysbiosis. – Role of aryl hydrocarbon receptor in lupus, MS and diabetes. – Involvement of macrophage-produced tumor necrosis factor alpha in preclinical models of colitis and colon cancer.
    – Effect of exercise in obesity and metabolic disorders. – Cellular and molecular mechanisms in induction of obesity and metabolic syndrome. - Cannabinoid receptor antagonists in the treatment of obesity. - Gut microbiome in obesity. – Role of exercise and obesity in muscle wasting disorders.
    – Use of chemoimmunotherapy in treatment of glioblastoma and neuroblastoma. – Targeting Sphingosine-1 phosphate in macrophages and mast cells for cancer therapy. – Role of microRNA in induction of apoptosis in tumor stem cells from neuroblastoma and melanoma. - Epigenetic regulation colon cancer by plant products. – Molecular mechanism underlying carinogenesis. – H. pylori induced carcinogenesis. – Characterization of spontaneous pain in colorectal cancer.
    – Epigenomic studies on the effects of plant products (resveratrol and cannabinoids) in the treatment of multiple sclerosis, colitis and obesity. – Effects of dietary supplements (indoles, etc.) on regulation the microbiome in colitis, acute lung injury, MS and obesity. – Role of exercise and dietary products (curcumin, quercetin and emodin) in breast and colon cancer as well as obesity-driven cancer progression. – Therapeutic efficacy of resveratrol and other AhR ligands on MS, lupus and diabetes. – Development of dietary quercetin to treat muscle wasting disorders. The effects of Ojeok-san on neuro-immune interactions in cancer-induced visceral pain.


Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

Les enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is an immunological assay commonly used to measure antibodies, antigens, proteins et glycoprotéines in biological samples. Some examples include: diagnosis of HIV infection, pregnancy tests, and measurement of cytokines or soluble receptors in cell supernatant or serum. ELISA assays are generally carried out in 96 well plates, allowing multiple samples to be measured in a single experiment. These plates need to be special absorbant plates (e.g. NUNC Immuno plates) to ensure the antibody or antigen sticks to the surface. Each ELISA measures a specific antigen, and kits for a variety of antigens are widely available.

The ELISA pictured in Figure 1 is what is known as a sandwich ELISA, here two sets of antibodies are used to detect secreted products, e.g. cytokines. The method is stepwise in the order shown. The 1st step is to coat the ELISA plate with capture antibody, any excess, unbound antibody is then washed from the plate. The capture antibody is an antibody raised against the antigen of interest.

Figure 1. ELISA method. Described above is a sandwich ELISA, showing the steps in the assay, numbered in order 1-4.

Next the échantillon (e.g. urine, serum, or cell supernatant) is added. Any antigen found in the sample will bind to the capture antibody already coating the plate. Samples are usually added in duplicate or triplicate (to allow for statistical analysis), and in varying concentrations to guarantee it falls within the levels of detection of the assay. Again any excess sample is washed from the plate.

In step 3, detection antibody est ajouté. This antibody is labelled with an enzyme, usually horse radish peroxidase or alkaline phosphatase. Detection antibody binds to any target antigen already bound to the plate. Finally, a substrate is added to the plate. ELISA assays are usually chromogenic using a reaction that converts the substrate (e.g. TMB or ABTS) into a coloured product which can be measured using a plate reader.

Determination of antigen concentration in a sample requires production of a standard curve using antigens of a known concentration (shown in Figure 2). The concentration of antigen in a sample can then be calculated using the optical density (OD).

Figure 2. A typical standard curve. Shown is a standard curve for an IFN-γ ELISA. To work out the concentration of antigen in a sample, a standard curve using a solution of known concentration needs to be prepared.


How does a lateral flow test work?

LFDs use immunoassay technology using nitrocellulose membrane, coloured nanoparticles (or labels), and typically antibodies, to produce results.

When a sample is added, the sample will flow along the test device passing through the conjugate pad into the nitrocellulose membrane and then onto the absorbent pad.

The bullet points below demonstrate how a sandwich assay travaux. Alternatively, click the play button on this image to watch a video.


Voir la vidéo: Prescription des biologiques dans la PR: comment choisir? Pr Ahmed Bezza (Août 2022).