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Comment inactiver définitivement la trypsine par ébullition ?

Comment inactiver définitivement la trypsine par ébullition ?


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Je dois effectuer une hydrolyse de la BSA avec l'enzyme trypsine. Comme contrôle, je veux inactiver l'enzyme trypsine. Puis-je l'inactiver définitivement en le faisant bouillir (100oC) pendant 10 minutes, ou faut-il 1 heure d'ébullition ? Après inactivation, je dois faire un test (avec une enzyme active) et un contrôle avec BSA à 37oC). À ce stade, la trypsine inactivée (le contrôle) ne doit pas être réactivée. Mes questions sont donc (1) si je peux inactiver de manière irréversible la trypsine en la faisant bouillir, (2) combien de temps je dois la faire bouillir et (3) si le processus d'ébullition inactivera de manière irréversible la trypsine.


D'après mon expérience, 10 minutes à 100 ° C sont suffisantes, cela est également soutenu par l'article lié ci-dessous. L'inactivation thermique fonctionne en dénaturant la protéine et est donc définitive. Selon ce que vous voulez faire avec votre échantillon, cela peut être problématique, car il est probablement aussi dénaturé au moins dans une certaine mesure.

Vous pouvez également inactiver chimiquement la trypsine, soit en ajoutant du sérum bovin fœtal (qui se fait en culture cellulaire), qui contient des inhibiteurs de protéase comme l'α1-antitrypsine et la α2-macroglobuline, soit en utilisant des inhibiteurs disponibles dans le commerce. La trypsine est également inhibée par les ions calcium et magnésium, donc vos tampons de réaction ne devraient en contenir aucun.


Vous pouvez également les considérer :

  • Ajouter le 2-mercaptoéthanol et chauffer à 95⁰ pendant 10 min [réf]
  • Ajouter le PMSF, incuber pendant un certain temps, puis chauffer pendant un certain temps (disons 70 ⁰ pendant 10 minutes) pour inactiver le PMSF résiduel.